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瓜子体外遗传毒性安全性评估 瓜面，又名瓜面、塔面、塔面、茧中心等，是甘蔗科植物的干燥成熟种子。 1 仪器和试药 1.1 实验设备 日本OLIMPUS倒置显微镜CKX41;日本OLIMPUS显微镜BX-4型;瑞士阿道夫科耐控温摇床AG LT-X;瑞士阿道夫科耐CO 1.2 鼠伤寒沙门氏菌回复突变株chl 中国仓鼠肺成纤维细胞 (Chinese Hamster Lung Fibroblast, CHL) 来自中科院上海生命科学院。外源大鼠肝微粒体组分 (S9) 、TA97、TA98、TA102、TA100、TA1535系列组氨酸缺陷型鼠伤寒沙门氏菌的标准菌株购于MOLTOX公司。 瓜蒌子饮片 (陕西兴盛德药业有限公司) , 按照《中国药典》外观、薄层色谱等方法 1.3 材料、实验方法 3, 29-二苯甲酰基栝楼仁三醇对照品购于上海诗丹德标准技术服务有限公司;MTT噻唑蓝, 购于上海炎熙生物科技有限公司。阳性对照物:环磷酰胺 (CP) 、丝裂霉素C (MMC) 、松胞素B (Cyto B) 、叠氮钠 (SA) 均购于SIGMA公司, 敌可松 (Dexon) 购于上海迈瑞尔化学技术有限公司。2-氨基蒽 (2-AA) , 购于TCI公司。 2 实验方法 2.1 检测瓜子的浓度 根据最新版世界经济合作与发展组织 (OECD) 遗传毒性指导原则, 不同溶剂对体外遗传毒性假阳性率影响较大, 用水提法提取瓜蒌子有效成分 2.2 细胞实验 2.2.1 本氨基蓝细胞mtt的活力试验 选用世界经济合作与发展组织 (OECD) 遗传毒性指导原则473 2.2.2 细菌回复突变试验pmes试验 按照GB/T 21786-2008细菌回复突变试验方法 2.2.3 体格检测 CHL细胞培养在6孔培养板内盖玻片上, 按照OECD遗传毒性指导原则TG 473 2.2.4 表面微测试 按照OECD体外微核试验指导原则TG487 式中:DC 细胞毒性=100-RI 2.3 数据的统计与分析 试验数据采用统计软件处理, 分析结果用 3 结果 3.1 s9对细胞生长的影响 各组细胞染毒后, 与阴性对照组细胞生长情况相比, 在阳性对照组药物作用下, 无论S9是否存在, 细胞生长均受到抑制, 细胞存活率显著下降, 见表1。与阴性对照组细胞存活率数据比较, 瓜蒌子水溶性浸出物各浓度接触组均没有显著差异, 也未呈现剂量依赖关系, 对CHL细胞活力均无显著影响。 3.2 测定结果及分析 各阳性对照组诱导营养缺陷型菌株回复突变菌落数与阴性对照组相比, 具有极显著性差异 (P0.01) , 说明测试有效性。各加药组回复突变菌落数尚未超过阴性对照组回复突变菌落数的2倍, 且不呈现剂量依赖关系, 由此判定瓜蒌子水溶性浸出物在此试验中没有诱发回复突变作用。试验结果见表2。 3.3 染色体畸变试验 通过对CHL细胞体外分别染毒6 h和24 h的对比, 加与不加S9染毒条件下, 阴性对照畸变率≤5%, 阳性对照与阴性对照畸变率差异极显著 (P0.01) , 瓜蒌子水溶性浸出物各浓度加药组染色体畸变率虽然随着染毒时间延长, 畸变率有上升趋势, 但是与阴性对照差异不明显 (P0.05) , 且未出现剂量依赖关系, 结果见表3。 3.4 对瓜子水溶液浸出物的致增殖微核试验结果 通过微核试验, 分别给CHL细胞在加与不加S9染毒条件下, 阳性对照与阴性对照微核率差异极显著 (P0.01) , 瓜蒌子水溶性浸出物各浓度加药组与阴性对照组细胞增殖未受到显著影响, 微核率差异不明显 (P0.05) , 且未出现剂量依赖关系, 结果见表4。 4 中药提升手段 运用现代分离提取工艺对中草药有效成分分离提纯, 是对传统中草药有效成分分析、功效发掘、药理研究、中成药剂型提升的必须手段。有研究表明, 瓜蒌子中富含油脂、甾醇、黄酮、挥发油等不易溶于水的有效成分 然而, 中药是复杂成分的组合体, 成分之间相互作用, 可改变中药的药性和毒性 5 测定瓜子及其中药配伍的毒性级别的客观标准 本次研究基于细胞分子水平的体外细胞毒性评价方法, 对建立瓜蒌子及其中药配伍的毒性级别的客观实验数据、安全性的评价模式, 以及对毒性机制的评价和潜在毒性的发现具有参考价值。