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n-连接糖基化位点突变感染性克隆的构建及鉴定 马蹄感染病毒（aav）和人免疫缺陷病毒（呼吸道感染，i-1）属于抗感染病毒科。 本试验对中国EIAV强毒辽宁株(L株)及弱毒株的序列(DLV株和FDD株)进行了测定和分析,我国马传染性贫血病毒强、弱毒囊膜基因gp90之间差异很大,具有明显的规律性。在病毒基因的V3到V5区,变异规律尤为明显,且与推定的N-连接糖基化的个数密切相关。经序列分析与氨基酸比较发现,在gp90基因V3到V5区,强毒存在3个N-连接糖基化位点,对应的位置是N-191位,N-236位,N-246位而弱毒的对应区域不存在N-连接糖基化位点。为此我们将感染性克隆p LGFD3-8株进行了糖化突变,构建了含有3个N-连接糖基化突变的分子克隆,并获得相应的衍生病毒。其结果为进一步研究N-连接糖基化在我国马传贫弱毒疫苗的致弱过程中的作用奠定了基础。 1 材料和方法 1.1 材料表面 1.1.1 主要试剂和仪器 EIAV全基因克隆质粒p LGFD3-8是基于低拷贝载体p LG338的基础上构建的EIAV驴胎皮肤细胞疫苗株全基因感染性克隆、驴胎皮肤细胞(FDD)、驴骀皮肤细胞弱毒(FDDV)、大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α、马传染性贫血病毒阳性血清和阴性血清均由哈尔滨兽医研究所慢病毒研究组提供。1.1.2主要试剂和仪器:FITC标记兔抗马Ig G购自Solarbio公司;脂质体转染试剂盒(Lipofectamine TM2000reagent)、鼠源反转录试剂盒(M-MLV Reverse Transcriptase)购自Invitrogen公司;Reverse Transcriptase Assay Colorimetric kit购自Roche公司;前病毒DNA及病毒RNA提取试剂盒均购自Qiagen公司。低温高速离心机(SIGMA,PK-15)、PTC-100TMProgrammable Therma Controller PCR仪(PTC-100TM,MJResearch.INC)、紫外分光光度仪(Ultraspec R3000,Pharmacia Biotech INC)、透射电子显微镜(JEM-1200EX,上海)、CO2恒温培养箱(WMZK-01,上海医用仪表厂)。 1.1.3 引用 1.2 循环循环,2s,6530s,6516s,7个循环 利用PCR技术进行定点突变,PCR反应体系为50μl,反应条件:95℃2min;95℃30s,55℃30s,75℃16min,18个循环;75℃16min。PCR反应结束后,加入Dpn I(20U),37℃消化1h,将消化后产物直接转化大肠杆菌DH5α,依据氨苄青霉素抗性初步判断是否完成突变,将初步筛选的阳性克隆送上海生工生物工程有限公司进行序列测定。 1.3 rlappcr检测n-1333-t-n-33 以1F、1R为引物,以p LGFD3-8为模板进行PCR。回收PCR产物2486bp的片段。将其连入p MD18-T中得到克隆p MD18-Tenv。在p MD18-Tenv上利用overlap PCR进行突变操作,以N-191-F、N-191-R为引物,获得了克隆p MD18-T-N191;以p MD18-T-N191为模板,以N-236-F、N-236-R为引物进行突变,获得了克隆p MD18-T-N191N236;以p MD18-T-N191N236为模板,以N-246-F、N-246-R为引物进行突变,获得了克隆p MD18-T-N191N236N246。用NcoⅠ、NruⅠ双酶切p MD18-T-N191N236N246,并与p LGFD3-8的NcoⅠ、NruⅠ双酶切的大片段相连获得了全基因克隆p LGN191N236N246。 1.4 颗粒转移和病毒遗传后代 用QIAprep Spin Miniprep Kit试剂盒,纯化质粒DNA至OD 1.5 反转录合成第一链cna 细胞接毒后培养10~15d,收集培养上清140μL按照试剂盒说明书操作提取病毒RNA并用DNA酶消化去除质粒污染。以2R为引物进行反转录合成第一链c DNA。以其为模板用2F、2R为引物进行PCR,其产物大小为1347bp。PCR反应条件:95℃5min;95℃30s,49℃30s,72℃1min,30个循环;72℃10min。取5μL PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳分析。 1.6 马血清学检测大鼠fddv感染细胞的表达 将FDD细胞传至96孔细胞培养板,24h后,接种vp LGFD3-8、vp LGN191N236N246,设立正常的FDD细胞和FDDV感染细胞作对照;37℃培养10d后,吸弃培养液,无水乙醇固定10min;0.5%PBST洗涤3次,每次3min,