第一章基因工程的分子遗传学基础演示文稿.pptVIP

（3）DNA片段末端修饰后进行连接 待连接的两个DNA片段经过不同限制性内切核酸酶酶切后， 产生的末端未必是互补黏性末端，或者未必都是平末端， 因此无法进行连接, 在这种情况下，连接之前必须对两个末端或一个末端进行修饰。 修饰的方式主要是 采用核酸外切酶Ⅶ（Exo Ⅶ）将黏性末端修饰成平末端； 采用末端转移酶将平末端修饰成互补黏性末端； 有时为了避免待连接的两个DNA片段自行连接成环形DNA， 或二聚体、多聚体，可采用碱性磷酸酯酶 将其中一种DNA片段5’末端的一P修饰成一OH。 当前第72页\共有144页\编于星期三\8点 （4）DNA片段加衔接头后连接 如果要连接既不具互补黏性末端又不具平末端的两种DNA片段， 除了上述用修饰一种或两种DNA片段末端后进行连接的方法外， 还可以采用人工合成的衔接头。 先将衔接头连接到待连接的1种或2种DNA片段的末端， 然后用合适的限制性内切核酸酶酶切衔接头， 使待连接的两种 DNA片段具互补黏性末端， 最后在DNA连接酶催化下使两种DNA片段连接，产生重组DNA分子。 此外，也可以根据两DNA片段的末端， 选用合适的衔接头直接把两DNA片段连接在一起。 当前第73页\共有144页\编于星期三\8点 3、激酶 通过催化ATP的γ-磷酸基共价附着在靶分子上，磷酸化特异的底物。 T4噬菌体多核苷酸激酶是一种磷酸化DNA或RNA5’羟基的酶。用于[γ-32P]ATP标记DNA5’端，也可对缺乏5’-磷酸的DNA或人工接头进行磷酸化。 细菌的碱性磷酸酯酶是一种去除DNA 5’-磷酸的酶。用于T4噬菌体多核苷酸激酶进行末端标记前除去5’-磷酸，或用来处理经 切过的载体DNA，防止其重新环化而降低转化效率。 当前第74页\共有144页\编于星期三\8点 T4-多核苷酸磷酸激酶(T4-PNP) 2009-11-26 66 当前第75页\共有144页\编于星期三\8点 三、 DNA聚合酶和RNA聚合酶 以单链DNA作为模板，DNA聚合酶和RNA聚合酶可直接合成互补的核酸。DNA合成时需要具有3’羟基的DNA或RNA作为引物，而RNA可起始从头合成。RNA聚合酶是催化RNA合成的酶。 DNA聚合酶的特性 PCR反应时，需要用耐高温的DNA聚合酶，即Taq DNA聚合酶，其在75℃具有最佳活性，对95 ℃高温具有良好的稳定性，该酶不存在3’→5’外切酶活性 当前第76页\共有144页\编于星期三\8点 大肠杆菌DNA聚合酶I（DNA polymerase I） 当前第77页\共有144页\编于星期三\8点 基本用途 当前第78页\共有144页\编于星期三\8点 T4 DNA聚合酶(T4 phage DNA polymerase) T4 DNA酶的基本特性： 有3`→5`的核酸外切酶活性和5`→3的DNA聚合 酶活性。 在无dNTP时，可以从任何3`-OH端外切 －在只有一种dNTP时，外切至互补核苷酸。 －在四种dNTP均存在时，聚合活性占主导地位。 当前第79页\共有144页\编于星期三\8点 基本用途 当前第80页\共有144页\编于星期三\8点 2009-11-26 55 当前第81页\共有144页\编于星期三\8点 基因工程中常用的工具酶 工具酶 功 能 限制性核酸内切酶 识别特异序列，切割DNA DNA连接酶 DNA聚合酶Ⅰ Klenow片段 反转录酶 多聚核苷酸激酶 末端转移酶 碱性磷酸酶 催化DNA中相邻的5′磷酸基和3′羟基末端之间形成磷酸二 酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接 ①合成双链cDNA分子或片段连接 ②缺口平移制作高比活探针 ③DNA序列分析 ④填补3′末端 又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的5′→3′聚 合、3′→5′外切活性，而无5′→3′外切活性。常用于cDNA第 二链合成，双链DNA 3′末端标记等 ①合成cDNA ②替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析 催化多聚核苷酸5′羟基末端磷酸化，或标记探针 在3′羟基末端进行同质多聚物加尾 切除末端磷酸基 当前第82页\共有144页\编于星期三\8点 * 测序酶：经修饰后消除了3’ 5’外切酶活性的T7 DNA聚合酶。 在体外反应中用含有双脱氧的核苷进行链的终止。 反转录酶：用来产生互补DNA（cDNA）；用于大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段可进行放射标记。 末端转移酶： 反应特点：底物：dNTP及衍生物，3个核苷酸，要求3’-OH 端，需要单链DNA作为引物，以3’-突起端的双