SN_T 4097-2015贝类派琴虫实时荧光PCR检测方法.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 4097—2015贝类派琴虫实时荧光PCR检测方法Real-time fluorescent PCR quarantine protocol for Perkinsus sp.in shellfish2015-09-01实施2015-02-09 发布中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 4097—2015前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局。本标准主要起草人：张雪、肇慧君、李叶、李振荣、贾赞I SN/T 4097--2015贝类派琴虫实时荧光PCR检测方法1范围本标准规定了贝类中派琴虫的实时荧光PCR检测方法。本标准适用于贝类组织中派琴虫的检测2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1实时荧光 PCR real-time fluorescent PCR在普通聚合酶链反应的基础上加人一条特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时，Taq酶的5-3外切酶活性将探针酶切降解，使报告基团和淬灭基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步，达到实时定量的目的。3.2Ct 值 cycle threshold每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数，也可称为Cp值。4试剂和材料4.1 1 mol/L Tris·Cl(pH 8.0)、0.5 mol/L EDTA溶液(pH 8.0)、SDS(10%)。溶液配制见附录 A。4.2蛋白酶K溶液（20 mg/mL)。4.3Tris-饱和酚。4.4 三氯甲烷。4.5异戊醇。4.6无水乙醇。4.7生理盐水。3 10XPCR buffer、25 mmol/L MgCl²、2.5 mmol/I dNTP、5 U/μL Taq 酶。4.84.910 μmol/L上游引物、10 μmol/L下游引物、10 μmol/L探针。4.10TE缓冲液(pH 8.0)。1 SN/T 4097--20155仪器和设备5.1组织研磨器。5.2电子天平。5.3冷冻离心机。5.4涡旋振荡器。5.5水浴锅。5.6超纯水机。5.7冰箱(2℃～8℃、-20℃、-80℃)。5.8高压灭菌锅。5.9实时荧光PCR仪。6检测步骤6.1　取样选取濒死的新鲜贝类样品，或者有感染派琴虫临床症状的样品（消化腺发白，贝壳不能闭合，套膜收缩，性腺发育受到抑制，生长迟缓等）。采集贝类的腮、套膜和消化腺等组织25 mg，置于冰冷的生理盐水中反复冲洗，用滤纸吸干表面水分，在液氮中冻5min，放至室温，再置于勾浆研磨器中并加入冷的生理盐水 50 μL，进行手工匀浆研磨。6.2DNA提取和纯化6.2.1将匀浆液倒人 1.5 mL离心管中,加入生理盐水补充体积至200 μL,加 20 μL蛋白酶K(20 mg/mL),再加SDS至终浓度为1%，上下颠倒混匀。6.2.2混合液置于55℃水浴锅内水浴2.5h。6.2.3向匀浆液中按1：1比例加人苯酚：三氯甲烷：异戊醇混合液（A.5），上下颠倒混匀，12000r/min离心5 min。6.2.4转移上层水相，加入等体积三氯甲烷：异戊醇混合液（A.6），上下颠倒混勾，12000r/min离心5 min.6.2.5转移上层水相，加人两倍体积的无水乙醇，一20℃放置30min或过夜。6.2.612 000 r/min离心5 min,沉淀 DNA,倾去上清液。6.2.7于沉淀中加人75%乙醇溶液500μL，轻轻混匀后12000r/min离心5min，倾去上清液，室温晾干。6.2.8用20μLTE缓冲液溶解DNA沉淀，一20℃保存备用。组织DNA提取也可采用等效的商品化DNA提取试剂盒，按照说明书进行操作。6.3实时荧光 PCR检测6.3.1实时荧光 PCR 引物该引物扩增派琴虫核糖体 DNA序列中的ITS区域基因序列,扩增片度长度为 69 bp，参见附录B。上游引物：5-TCAAAACGAAATTCCAAACTCTCA-3”下游引物:5-CTTCGCTGCGTCCTTCATC-3Taqman 探针 :5-FAM-CGATGGATGCCTCGGCTCGAG-ECLIPSE-32 SN/T 4097—2015引物与探针合成后配制成100 u