NY_T 1674-2008牛羊胚胎质量检测技术规程.pdf

ICS 65.020.30B 44NY中华人民共和国农业行业标准NY/T羊胚胎质量检测技术规程Detection procedures for quality evaluationin embryos of bovine and ovine2008-08-28 发布2008-10-01实施中华人民共和国农业部发布 NY/T 1674—2008前 言本标准的附录A为规范性附录，附录B和附录C为资料性附录。本标准由中华人民共和国农业部畜牧业司提出。本标准由全国畜牧业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：全国畜牧总站。本标准主要起草人：王志刚、刘丑生、朱玉林、赵俊金、孙秀柱、于福清、张桂香、孙飞舟。I NY/T 1674—2008牛羊胚胎质量检测技术规程1 范围本标准规定了牛羊胚胎形态评定和发育情况检测技术规程。本标准适用于新鲜的、冷冻的体内胚胎和体外胚胎的质量检测。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T5458液氮生物容器GB/T18088出入境动物检疫采样3术语下列术语和定义适用于本标准。3. 1超低温保存cryopreservation在一196℃的超低温度中，胚胎新陈代谢停止，从而使其长期保存。3. 2胚胎解冻embryothawing将冷冻保存的胚胎按一定的程序融化，并脱除冷冻保护剂，使胚胎恢复新陈代谢的过程。3.3胚胎体外培养embryoin vitro culture胚胎在体外培养液中模拟体内环境培养，使其继续发育的过程。4抽样方法和保存4.1抽样方法抽样方法和数量参照GB/T18088。4.2样品的保存样品应保存在一196℃的液氮环境中，并符合如下条件：-存放冷冻胚胎的低温容器应符合GB/T5458规定，使用前经过清洗后加人液氮。取放样品-时，在空气中暴露时间不能超过5s。样品由专人保管，不能脱离液氮。4.3信息的记录抽样时，应详细记录样品包装上标记的信息。5检测环境应在洁净环境条件下进行检测。1 NY/T 1674---20086检测方法牛羊胚胎质量检测操作方法见附录A。结果表述××胚胎的发育阶段为×××；级别为××；在38℃～39℃、5%二氧化碳、95%空气和相对饱和湿度条件下培养24h(或48h)，胚胎由XX阶段发育到××阶段。2 NY/T 1674—2008附录A（规范性附录）牛羊胚胎质量检测操作方法A.1 试剂A.1.1胚胎培养液(推荐使用TCM199+20%FCS)A.1.2 甘油A.1.3 乙二醇(EG)A.1.4蔗糖A.1.5PBS配方PBS配方见表A.1。表A.1PBS配方浓度试剂名称NaCl8. 0 g/ LKCI0. 20 g/ LA液CaCl20. 10 g/ LMgCl2 · 6H200. 20 g/ L2. 16 g/ LNaz HPO, : 7H2 0B液KH2 PO,0. 20 g/ LA.1.5.1配制好的A、B液分别高压灭菌，保存待用。A.1.5.2使用前，把B液缓慢倒入A液，充分混合，每1L溶液中添加丙酮酸钠0.036g、葡萄糖1.0g、牛血清白蛋白4.0g(或灭活血清10mL～20mL)和抗生素（青素100U/mL、链霉索100μg/mL)，充分混合后定容，用0.22μm滤器过滤除菌，待用。配成的PBS液pH为7.2～7.3，渗透压290m)sm~300 mOsm.A.1.6成品PBS配制A.1.6.1用灭菌双蒸水分别将A、B原粉溶解，用容量瓶定容到1000mL。A.1.6.2加人灭活血清10mL～20mL,充分混匀待用。A.1.7保存液：含0.4%牛血清白蛋白的PBS液。A.2仪器设备A.2.1二氧化碳培养A.2.2胚胎冷冻仪A.2.3液氮罐A.2.4体视显微镜A.2.5恒温台A.2.6电子天平(精确到0.1mg)A.2.7超净工作台3 NY/T 1674--2008A.2.8超声波清洗器A.2.9超纯水器A.2.10电热鼓风干燥箱A.2.11高压灭菌器A.3检测内容与方法A.3.1待检胚胎应有完整的系谱资料(适用于体内胚胎和活体采卵体外受精胚胎)A.3.2样品包装的标记应规范完整A.3.3胚胎质量A.3.3.1检测方法A.胚胎的形态学检测借助于显微镜对胚胎的发育阶段和发育状况进行形态学观察。A.胚胎的体外发育能力检测在38℃～39℃，5%二氧化碳、95%空气和相对饱和湿度的条件下，对胚胎进行体外培养并于24h或48h观察胚胎的存活情况和发育阶段。A.冷冻胚胎应按照程序要求进行解冻后检测，胚胎解冻程序参见附录B。A.3.