SN_T 3495-2013牛及其产品中转基因成分实时荧光PCR检测方法.pdf

5N中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3495-2013牛及其产品中转基因成分实时荧光PCR 检测方法Protocol of the real-time PCR for detecting genetically modifiedcomponent in cows and their derived products2013-03-01发布2013-09-16实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 3495—2013言前本标准按照GB/T1.1—-2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国安徽出入境检验检疫局、中国农业大学、北京市畜牧兽医总站、中华人民共和国宁波出人境检验检疫局。本标准主要起草人：刘建、朱振营、贾广乐、吕继洲、林祥梅、王建武、郑海松、薛振华、王慧煜、冯春燕、廖娟红、王建峰。I SN/T 3495—2013牛及其产品中转基因成分实时荧光PCR 检测方法1 范围本标准规定了牛及其加工产品中转基因成分的实时荧光PCR检测方法。本标准适用于转人乳铁蛋白基因奶牛、转人α-乳清白蛋白基因奶牛、转人溶菌酶基因奶牛及肉制品、奶制品等转基因成分实时荧光PCR检测。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3缩略语下列缩略语适用于本文件。β2 m:β 2 微球蛋白(β 2-microglobulin)。bp:碱基对(base pair)。CMV:巨细胞病毒（cytomegalovirus）。Ct：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数（cycle threshold）。dATP:脱氧腺苷三磷酸(deoxyadenosine triphosphate)。dCTP:脱氧胞苷三磷酸（deoxycyticine triphosphate）。dGTP:脱氧鸟苷三磷酸(deoxyguanosine triphosphate)。dTTP:脱氧胸苷三磷酸（deoxy thymidine triphosphate)。dUTP:脱氧尿苷三磷酸（deoxyuridine triphosphate）。DNA:脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid）。GFP:绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein)。hLA：人乳清蛋白（huaman lactobumin）。hLF：人乳铁蛋白（huaman lactoferrin）。hLY:人溶菌酶(huaman lysozyme)。NPT Ⅱ:新霉素-3-磷酸转移酶基因（neomycin-3-phosphotransferase gene）。SV40:猿猴空泡病毒 40(Simian Vacuolating virus 40)。PCR:聚合酶链反应（polymerase chain reaction）。Taq 酶:聚合酶(DNA）。TE:Tris-Hcl、EDTA缓冲液。Tris:三(羟甲基)氨基甲烷(tris hydroxymethyl aminomethane)。1 SN/T 3495—20134 实验方法4.1主要仪器4.1.1实时荧光定量PCR仪。4.1.2超净工作台。4. 1.3核酸蛋白分析仪。4.1.4　高速冷冻离心机，台式小型离心机，Mini个人离心机。4.2主要试剂除另有规定外，所有试剂均采親分析纯或生化试剂。实验用水：应符合GB/T66821一级水的规定。.2PCR缓冲液。4.2.3氯化镁（MgCl²）。dNTPs(dATP,dTTP、dCTP.dGPP)4.2. 44.2.5Taq酶。其他药品及试剂配制方法见附录A。引物和探针按照表1中提供的引物和探针序列合成引物及探针加人无离子水配成100pmol/μl.贮存，配成直接用于 PCR反应的10pmol/μL的工作液。表 1检测转基因动物内外基因所需的引物序列基因接针序列动物序列备注被检测基因来源5-CTGCTA1GTTATGGGTTGC-3-AGACAGQTCTGACTGCTCC5-牛32m内对照内源TIGC-3GATTTAATC-35-GTAGAAAGACGAGGGCACAACAGAC-35-TATGACT?-CTGCTCTGATGCCGCCGTGNPT I筛套检测外源5′-CGTCTTGCAGTTCATTCAG-3TTCC-3 5-GTTCCGCGTTACATAAC-TTACGG-3CCGCCTGGCTGACCGCCCACMV外源筛查检测5′-AAGTCCCTATTGGCGTTACTATGG-3AC-3 5′-