NY_T 1805-2009胡椒种苗黄瓜花叶病毒检测技术规范.pdf

ICS 65.020B 16NY中华人民共和国农业行业标准NY/T 1805—2009胡椒种苗黄瓜花叶病毒检测技术规范Technical criterion of Cucumber mosaic virus detection on pepper2009-12-22 发布2010-02-01实施中华人民共和国农业部发布 NY/T 1805—2009前言本标准的附录A、附录B为规范性附录本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由农业部热带作物及制品标准化委员会归口。本标准起草单位：中国热带农业科学院热带生物技术研究所、国家重要热带作物工程技术研究中心。本标准主要起草人：刘志昕、王健华、牛立霞、陈业渊。I NY/T 1805—2009胡椒种苗黄瓜花叶病毒检测技术规范警告一一使用本标准的人员应有正规实验室工作的实践经验。本标准并未指出所有可能的安全问题。使用者有责任采取适当的安全和健康措施，并保证符合国家有关法规规定的条件。1范围本标准规定了胡椒种苗黄瓜花叶病毒（Cucumbermosaicvirus，CMV)双抗夹心酶联免疫吸附测定(DAS-ELISA)及反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)分子生物学检测方法，本标准适用于胡椒插条苗以及插条苗枝序中的黄瓜花叶病毒的检测。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。NY/T360胡椒插条苗3仪器和用具3.1主要仪器台式冷冻离心机、PCR仪、水平电泳装置、凝胶成像系统、电冰箱、水浴锅、酶标仪、恒温培养箱。3.2用具及耗材微量移液器、研钵、酶联板、离心管、PCR管、移液器吸头。4取样出现花叶症状的疑似病株或插条苗（见NY/T360），取显症叶片.3片～5片；无症状植株或插条苗，取完全展开的淡绿期叶片3片～5片。于4℃条件下保湿存放待检，最多存放7d。制样时从不同叶片剪取适量叶片组织，制备成混合样品。5检测方法5.1双抗夹心酶联免疫吸附测定(DAS-ELISA)法5.1.1样品制备从取样（保存）材料中切取0.5g~1.0g组织，加人5mL抽提缓冲液研磨，4000r/min离心5min，取上清液作试样，4℃条件下保存备用。阳性样品为已知带CMV的材料或试剂盒提供的阳性对照，阴性样品为已知不带CMV的材料或试剂盒提供的阴性对照，按同样方法制备和保存。5.1.2操作步骤包被抗体：每孔加100μL用包被缓冲液按工作浓度稀释的CMV抗体，37℃保湿孵育2h~4h或4℃条件下保湿过夜。洗板：用PBST洗液洗板4次，每次3min~5min。封闭：每孔加人200μL封闭液，37℃保湿孵育1h～2h。1 NY/T1805—200洗板：同。加检测样品：每孔加人100μL试样，设阴性、阳性和空白对照（样品提取缓冲液），可根据需要设置重复，37℃条件下保湿孵育4h，或4℃条件下过夜。洗板：同。加酶标抗体：每孔加人100μL经ECI缓冲液稀释至工作浓度的碱性磷酸酯酶标记抗体，37℃保湿孵育2h～4h。洗板：同。加底物溶液：每孔加人100μL含1mg/mLPNP的底物显色缓冲液，在室温下避光保湿孵育30 min~60 min。0终止反应：每孔加人50μL3mol/LNaOH终止反应，在酶标仪上测定波长405nm吸光值（OD405），并打印结果。5.1.3结果判定样品OD405值/阴性对照OD405值大于或等于2，判为阳性；样品OD40s值/阴性对照OD405值小于或等于1.5时判为阴性；样品OD405值/阴性对照OD405值在1.5至2之间，应经进一步确认。5.2反转录-多聚合酶链式反应(RT-PCR)检测法5.2.1引物上游引物 P1:5-GATGGACAAATCTGAATC-3;下游引物P2:5-TCAAACTGGGAGCACC-3；预期扩增片段大小为657bp。5.2.2操作步骤总RNA提取取1g样品加液氮在大小合适的离心管或研钵中研磨成粉末，转至2mL离心管，加600uL水饱和酚与600μL2×RNA抽提缓冲液，混匀，4℃12000r/min离心20min，上清液转移至新离心管，加等体积4mol/LLiCl，混匀后4℃沉淀过夜，4℃12000r/min离心20min，沉淀用70%乙醇漂洗数次，风干，用30uLDEPC处理过的水溶解，一70℃保存备用。采用RNA提取试剂盒的，操作步骤参照产品说明书。阳性样品为已知带CMV的材料或CMV提纯液，阴性样品为已知不带CMV的材料，按同样方法制备和保存。反转录及PCR反应以样品总RNA，以及阴性、阳性对照总RNA为模板，可选用一步法RT-PCR试