生化实验质粒DNA提取.pptVIP

SDS：是一种离子型表面活性剂，其主要功能是溶解细胞膜上的脂质和蛋白质，因而溶解膜蛋白，破坏细胞膜；解聚细胞中的核蛋白；SDS能与蛋白质结合，使蛋白质变性而沉淀下来，为后续处理需要。 注意： 1、处理时间不能过长；否则碱性条件下基因组DNA会慢慢断裂 2、温柔混合；避免机械剪切导致已经变性的基因组DNA断裂 SDS:十二烷基硫酸钠 当前第29页\共有41页\编于星期四\4点 溶液3：是大部分蛋白质和细菌基因组DNA沉淀 溶液3（PH=4.8）：0.5M 60ml KAC 11.5ml冰醋酸 28.5ml 水 本质上是KAC-HAC的缓冲液；用PH=4.8的溶液3是为了把强碱性的提取液调回至PH中性，使变性的质粒DNA能够复性并稳定存在 当前第30页\共有41页\编于星期四\4点 KAC：SDS能与蛋白质结合，SDS能与KAC生产PDS，PDS的溶解度要比SDS低得多，从而使大部分的蛋白质与细菌基因组DNA一起沉淀，使沉淀更完全。另外可以中和核酸上的电荷，减小相斥力，有利于变性的大分子染色体DNA、RNA互相聚合而沉淀下来。 为何加入溶液3之后出现大量的沉淀？这沉淀的本质是什么？ 这里还需把SDS除掉的原因是？ 当前第31页\共有41页\编于星期四\4点 生化实验质粒DNA提取演示文稿 当前第1页\共有41页\编于星期四\4点 生化实验质粒DNA提取 当前第2页\共有41页\编于星期四\4点 2、严瑾型质粒：严瑾型质粒的复制需要一个质粒编码的蛋白，质粒的拷贝数不能通过氯毒素等蛋白合成抑制剂来增加。 当前第3页\共有41页\编于星期四\4点 质粒类型 质粒按复制方式可以分为两种类型： 1、松弛型质粒：松弛性质粒的复制不需要质粒编码的功能蛋白，完全依赖于宿主提供的半衰期较长的酶，即使蛋白质合成受到抑制，质粒的复制依旧进行。 当前第4页\共有41页\编于星期四\4点 质粒的应用 1、大多数基因工程使用的是松弛型质粒 2、严瑾型质粒用来表达一些可使宿主细胞受毒害致死的基因。 3、质粒的特点使质粒成为外源基因进入细菌中扩增或表达的重要媒介物，这种基因工具在基因过程中具有极其广泛的应用价值。 当前第5页\共有41页\编于星期四\4点 质粒的性质中与载体作用关系密切的包括： 1、质粒的复制型 2、质粒的不相容性 3、质粒的接合性 4、多克隆位点 5、筛选标记 当前第6页\共有41页\编于星期四\4点 1、质粒能在细菌中垂直遗传，并且赋予宿主细胞一些表型，是比病毒更简单的原始生命。 质粒通过细菌的结合作用，从雄性体转移到雌性体，是细菌有性繁殖的性因子，1952年由Lederburg正式命名为质粒。 当前第7页\共有41页\编于星期四\4点 质粒特点 质粒对细菌本身的生长繁殖不是必需的，但可以赋予细菌一定的表型，如抗药性等。 它是基因操作工程中常用工具中载体的一种。是携带目的DNA片段进入受体细胞进行扩增和表达的工具。 当前第8页\共有41页\编于星期四\4点 人工基因工程获得胰岛素 首先获得胰岛素基因，再将胰岛素基因转入大肠杆菌内，再创造大肠杆菌增殖的有利环境，对大肠杆菌进行大规模培养，使之产生大量的治疗糖尿病的药物--胰岛素，提取纯化。 当前第9页\共有41页\编于星期四\4点 分离质粒DNA的方法 从大肠杆菌中分离质粒DNA的方法众多，目前常用的有: 1、碱裂解法 2、煮沸法 3、SDS法 4、羟基磷灰石层析法 …… 当前第10页\共有41页\编于星期四\4点 这几种方法概括起来说主要采用非离子型或离子型去污剂，有机溶剂或碱进行处理及加热处理 所有分离质粒DNA的方法都包括三个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离质粒DNA 当前第11页\共有41页\编于星期四\4点 选择哪一种方法取决于以下几个因素： 1、质粒的大小 2、大肠杆菌菌株 3、裂解后用于纯化的技术和实验要求 当前第12页\共有41页\编于星期四\4点 各种方法分离是依据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成及结构结构等特点加以选择的，其中碱变性法既经济且回收效率高，提取的质粒DNA可用于酶切，连接和转化。 当前第13页\共有41页\编于星期四\4点 质粒DNA的提取 当前第14页\共有41页\编于星期四\4点 实验目的 掌握碱裂解法抽提质粒的原理、步骤及各主要试剂的作用。 当前第15页\共有41页\编于星期四\4点 质粒 (plasmid) 共价、闭合、环状的小分子量DNA； 能在宿主细胞内独立自主复制； 带有某些遗传信息, 会赋予宿主细胞一些遗传性状。 实验原理 当前第16页\