DB34T 3244-2018霍山石斛分子鉴定技术规程.docxVIP

ICS 65.020 B 39 安 徽 省 地 DB34 方 标 准 DB 34/T 3244—2018 霍山石斛分子鉴定技术规程 The technical specifications for molecular indentification of Dendrobium huoshanense C. Z. Tang et S. J. Cheng 文稿版次选择 2018 - 12 - 29 发布 2019 - 01 - 29 实施 安徽省市场监督管理局 发 布 I DB34/T 3244—2018 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 本标准由皖西学院提出。 本标准由安徽省林业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：皖西学院、霍山县石斛(灵芝)产业发展办公室。 本标准主要起草人：赵群、陈乃富、陈存武、韩邦兴、孙传伯、戴军、宋向文、陈乃东、姚厚军、 李世海。 1 DB34/T 3244—2018 霍山石斛分子鉴定技术规程 1 范围 本标准规定了霍山石斛(Dendrobium huoshanenseC. Z. Tang et S. J. Cheng)分子鉴定的术语 与定义、分子鉴定技术、资料记录和档案管理。 本标准适用于霍山石斛与河南石斛、细茎石斛、铁皮石斛、金钗石斛之间的定性分子鉴定。 鉴定材料包括以上各种石斛的根、茎、叶、花、果实以及干条、枫斗、切片和含有霍山石斛成分的 粉末。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件， 仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 DB34/T 486 霍山石斛 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 特异性引物 specific primer 能特异性扩增霍山石斛 ITS 或 trnL-trnF DNA 片段的位点特异性鉴别引物。 3.2 标准物种的特异性扩增片段 the specific sequence of standard species 用特异引物 CP2s 和 CP2a 扩增出的霍山石斛 DNA 片段。 3.3 标准物种扩增片段的特异性位点 the specific site of the sequence of standard species 用特异性引物 HuoS 和 HuoA 扩增的片段中在 5’→ 3’ 方向第 56 位的碱基 G。 4 分子鉴定技术 4.1 仪器设备及试剂 仪器设备及试剂见附录A。 4.2 溶液配制 2 DB34/T 3244—2018 溶液配制方法见附录B。 4.3 引物 通用引物 TY2s： 5’- CGCCATATTGATTGACACG -3’ 通用引物 TY2a： 5’- GGCAGCCAACGAGAAGA -3’ 特异性引物 CP2s： 5’- TTCGTGGGATGGGGTTC -3’ 特异性引物 CP2a： 5’- TGCACATCCGAGCCTGA -3’ 特异性引物 HuoS： 5’- AAAAGGGATAGGTGC -3’ 特异性引物 HuoA： 5’- GATTTGGGTTGTGATT -3’ 4.4 操作程序 4.4.1 DNA 提取 4.4.1.1 取干燥样品 50 mg 或新鲜样品 100 mg。用 CTAB 法提取总 DNA。具体过程详见附录 C。 4.4.1.2 所获 DNA 质量能够符合 PCR 扩增需要的 DNA 提取方法都适用于本标准。 4.4.1.3 样品应符合 DB34/T 486 的规定。 4.4.2 PCR 扩增 4.4.2.1 反应体系 反应体系总体积为 25 μL，反应组分配制如下。 ——DNA 模板 0.5 μL(5- 50 ng)，上游引物 1 μL(10 pmol)， 下游引物 1 μL(10 pmol) ， 10×PCR Buffer 2.5 μL，MgCl2(25 mM)1.5 μL，dNTPs(10 mM)0.5 μL，Taq DNA 聚合酶 (5 U/μL) 0.5 μL，ddH2O 补足至 25 μL。 4.4.2.2 反应程序 反应程序可根据引物不同选下列程序中的一种。 ——程序 1：95℃ 5 min、35 个循环(每个循环包括 95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s) 、72℃ 10 min。所用引物为通用引物 TY2s 和 TY2s。 ——程序 2：95℃ 5 min、45 个循环(每个循环包括 95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s) 、72℃ 10 min。所用引物为特异性引物 CP2s 和 CP2a。 ——程序 3：95℃ 5 min、3