SN_T 3434-2012杨树炭团溃疡病菌检疫鉴定方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T3434—2012杨树炭团溃疡病菌检疫鉴定方法Detection and identification of Hypoxylon mammatum (Wahlenberg)J. Miller2013-07-01实施2012-12-12发布中华人民共和国发布0国家质量监督检验检疫总局层查真药 SN/T 3434—2012前 言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国山东出入境检验检疫局。本标准主要起草人：吴兴海、陈鹏、白桦、王英超、厉艳。- SN/T 3434-2012杨树炭团溃疡病菌检疫鉴定方法1范围本标准规定了进出境种苗、原木及木质包装检疫中杨树炭团溃疡病菌的检疫和鉴定方法。本标准适用于进出境植物及其产品中杨树炭团溃疡病菌的检疫和鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。SN/T1157进出境植物苗木检疫规程3杨树炭团溃疡病菌基本信息学名：Hyporylonmammatum（Wahlenberg)J.Miller异名:Hyporylon pruinatum （Klotzsch）Cooke;Entoleuca mammata;Sphaeria mammata;Nemania mammata ; Sphaeria pruinata ; Rosellinia pruinata ; Hyporylon pauperatum ; Anthostomamorsei;Hyporylonmorsei;Hyporylon blakei;Anthostomablakei;Hyporylonholrwayi;Fuckelia morsei俗名：Blackstemcanker分类地位：子囊菌门（Ascomycota），子囊菌纲（Ascomycetes），炭角菌目（Xylariales），炭角菌科（Xylariaceae），炭团菌属（Hyporylon）。传播途径：杨树炭团溃疡病菌主要是种气传病害。可通过风、雨、昆虫、修剪工具等进行传播。杨树炭团溃疡病菌的其他信息参见附录A。4方法原理根据杨树炭团溃疡病菌的形态特征、致病性测定的症状特征对该病菌进行检疫鉴定及结果判定。5仪器和用具超净台、生物培养箱、荧光显微镜、离心机、涡旋器、生物显微镜、体视显微镜、光照培养箱、高压灭菌器及其他常规实验室设备器具。6药品试剂与培养基NA培养基、2%次氯酸钠或75%乙醇、甘露醇、6-苯氨基嘌岭（6-BA）、2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）、3-吲哚丁酸（IBA）、改良B5培养基、WPM培养基等。1 SN/T 3434—20127现场检疫7.1抽样方法对来自杨树炭团溃疡病菌发生国家和地区（参见附录A)的寄主植物及其产品按SN/T1157进行抽样。7.2症状检查在寄主植物上，症状在植株外表皮上初期表现为橙黄色、水渍状的凹陷.并逐渐形成绿色块状开裂，周缘黄色；后期在水泡状的外皮下出现灰色或橄榄绿色闭块状纽织和特征化的钉状精配子柱；由凹陷处或块状外表皮边缘向内切开皮层、维管束，皮层量现层状或斑驳状，颜色为淡黄色或黑色，形成层出现白色的扇状菌丝体。在组织培养再生苗上：，症状表现为叶片萎缩、部表皮变黑。组织收集可疑植物材料一并带回实验室检验。具体症状参见附录A。8实验室检测8.1病原菌分离与培养对于具7.2中初期症状的样品材料，则用解剖刀切取长植物举段，装入铺有潮湿纸巾的广口瓶中。盖上盖子，放人培养箱中，在24℃一28℃、95%～100%湿度下保湿瑶养。从第4天开始观察，检查外皮症状（表皮由绿色块状变为水泡状，局部表皮向上翘起并进二步裂开，最终露出精配子柱）。对于具典型症状的样品材料，检查子实体结构，切取白色或焦色子座，在解剖镜（或100×～200×的显微镜)下，通过徒手切片或石蜡片制成玻片/显微镜下观察子囊壳和子囊孢子。若发现子囊孢子，挑取单个孢子进行单孢分离，形成菌落后移至NA培养基纯化。若发现菌丝，用灭菌针挑取菌丝分离培养纯化。对于无明显症状的样品取其伤口或开裂处组织切成细条，在75%的酒精溶液中浸泡1min，取出后用2%次氮酸钠溶液进行表面消毒5mif，无菌水洗3次启转至NA培养基，24℃～28℃下培养2d～4d，用灭菌挑针挑取组织埃边缘的菌丝,淇其转移至另外的NA培养基上纯化。注意观察菌落特征，记录菌落和菌丝体特征，测定精配子（柱厂子囊和子囊孢子的大小。8.2致病性测定8.2.1致病性接种应在无菌的条件下完成，接种寄主可选用易感品种美洲山杨（Populustremuloides）的无性繁殖体系。选取高度为