湖北省克氏原螯虾携带白斑病病毒的初步调查.docxVIP

湖北省克氏原螯虾携带白斑病病毒的初步调查 0 养殖产业的病害与损害 克氏原始锚状虾属于甲壳类、甲壳类、头状脑、下叶虾和前叶虾科。它是中国重要的淡水养殖品种。近年来, 克氏原螯虾养殖产业发展迅速, 其产量从2007年的26.55万t到2016年85.23万t, 呈现了逐年上升的趋势。其中, 湖北省2016年克氏原螯虾的总产量达到了48.9万t, 占到了全国总产量的57.4%, 名列全国第一。在2016年全国小龙虾各县市产量排名中, 湖北省监利县、洪湖市、潜江市分别以9.72万t, 7.47万t, 4.58万t排名前三位。克氏原螯虾以其丰富的蛋白营养、鲜艳的色泽、鲜美的味道获得了消费者的喜爱, 推动了克氏原螯虾产业的快速发展。但是, 随着养殖业的发展, 病害逐渐增加, 给养殖业造成了一定的损失。尤其是近年来白斑综合征病毒 (White Spot Syndrome Virus, WSSV) 的感染给克氏原螯虾养殖产业造成了巨大的损失。 白斑综合征病毒, 是一种双链杆状DNA病毒, 其核酸为环状双链DNA。WSSV属于新设立的线极病毒科 (Nimaviridae) , 白斑病毒属 (Whispovirus) 的唯一种 当前, 克氏原螯虾已成为湖北省的特色产业之一 1 材料和方法 1.1 实验材料 1.1.1 克氏原螯虾群体发生率 于2016年5月—2017年7月, 分别采集了洪湖市、潜江市、鄂州市、随州市、监利县5个县市7个区域的克氏原螯虾群体共计741个样本 (表1) 。 1.1.2 蛋白酶k 细胞裂解液[10 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0) , 100 mmol/L EDTA (pH 8.0) , 2%SDS], 蛋白酶K (Proteinase K, 规格5 mL, 浓度≥600 mAnson U/mL) , 琼脂糖 (规格100g) , dNTPMixture (规格250μL, 10mmol/L) 、rtaq酶 (包括TaKaRa Taq 1.2 实验方法 1.2.1 tsyndr模型 根据Genbank基因数据库中WSSV[White spot syndrome virus (taxid:342409) ]保守序列设计1对特异性引物VPw-F1/R1, 同时根据WSSV序列 (AF369029) 设计1对特异性引物 1.2.2 离心-实际样品的制备 取克氏原螯虾的组织约0.1 g于2 mL离心管中, 向其中加入600μL的细胞裂解液, 用消毒后的小剪刀将组织剪碎后, 加入12μL浓度为20 mg/mL的蛋白酶K (以上操作均需要在冰上操作) , 将混合溶液充分混合均匀以后, 放入58℃水浴条件下消化2 h左右, 直到溶液中的组织完全溶解。 将消化水解液取出冷却至室温, 加入200μL浓度为10 mol/L的醋酸铵溶液, 颠倒混匀2～3 min, 看到有沉淀产生后, 使用高速离心机在12000 r/min离心8 min, 取上清液至另一个洁净的离心管。加入等体积的已经在-80℃条件下预冷15 min的异丙醇, 颠倒混匀后, 使用离心机12000 r/min离心8 min, 弃去上清液, 使用70%乙醇洗涤沉淀2～3次。等到沉淀表面的水分自然干燥后, 加入100μL灭菌的双蒸水溶解, 置于冰箱-20℃条件下保存备用。 1.2.3 rtaq酶活性染料ldntps4. 分别用3对引物分别进行PCR扩增。反应体系为25μL:10×PCR扩增缓冲液 (含有镁离子的buffer) 2.5μL;d NTPs 0.5μL;引物0.5μL;rTaq酶0.3μL;DNA模板0.3μL, 加双蒸水至总体积为25μL。PCR反应的条件为:94℃预热变性10 min;94℃变性1 min, 55℃退火1 min, 72℃延伸2 min, 共35个循环;72℃延伸7 min。将PCR反应产物进行1%琼脂糖凝胶电泳观察记录结果。 2 结果与分析 2.1 克氏原螯虾不同组织取样效果分析 由于携带WSSV病毒的克氏原螯虾患病初期的症状不是很明显, 养殖的克氏原螯虾无法通过外观判别是否携带WSSV病毒。需要通过PCR手段取组织样品进行检测。为了保证取样后克氏原螯虾仍然可以存活, 比较了不同的组织取样效果, 以确定克氏原螯虾最佳的WSSV病毒检测组织, 分别取9只克氏原螯虾的触角、螯肢、附肢、游泳足、尾扇5种组织, 比较了WSSV的检测结果 (图1, 表3) 。结果发现, 剪取附肢对克氏原螯虾的损伤最小, 且检测效果亦较好。而取螯肢组织、游泳足组织对克氏原螯虾损伤较大, 触角组织、游泳足组织、尾扇的肌肉组织含量较低, 需要的取样量比较大, 对克氏原螯虾的损伤亦比较大。 2.2 wssv携带情况 对湖北省潜江市新沟镇、监利县汴河镇、洪湖市新堤、