SN_T 3505-2013犬恶丝虫病检疫技术规范.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3505—2013犬恶丝虫病检疫技术规范Quarantine protocol for canine dirofilariasis2013-03-01发布2013-09-16实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局全家查真伪 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犬恶丝虫病检疫技术规范SN/T3505-2013*中国标准出版社出版北京市朝阳区和平里西街甲2号（100013）北京市西城区三里河北街16号（100045）总编室：（010址中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷*开本880×12301/166印张0.755字数18千字2013年8月第一版2013年8月第一次印刷印数1-1600*书号：155066·2-25826定价16.00元 SN/T 3505-2013前言本标准按照GB/T1.1--2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国四川出入境检验检疫局、四川农业大学、中华人民共和国重庆出人境检验检疫局。本标准主要起草人：余华、杨光友、岳川、王昱、严玉宝、李应国、刘洋洋、陈世界、周岷江、胡娟、崔鹏博。1 SN/T 3505-2013犬恶丝虫病检疫技术规范1范围本标准规定了犬恶丝虫的检疫技术规范。本标准适用于犬恶丝虫的形态观察、PCR检测及抗体检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必还可少的。凡是注日期的引用文件仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3形态观察3.1设备和器材3.1.1普通离心机。3.1.2光学显微镜。3.1.3体视显微镜。3.1.4解剖器材。3.2试剂和材料3.2.12%（体积分数）甲醛水溶液3.2.2美蓝染色液，配制见附录Al的A.3.3微丝观察（改良柯氏试验）采集待检动物外周血5mL，每毫升加人9mL2%甲醛水溶液，混合后1500r/min离心10min，去上清液，取少量沉渣，美蓝染色，镜检观察，并拍照记录。犬恶丝虫微丝坳的主要形态特征为：大小为（218μm～329μm）×（5μm～7μm），无鞘膜，前段呈尖锥状，后端细长、较直。染色后虫体呈蓝色，参见附录B。3.4成虫观察解剖患病动物，检查其右心室和肺动脉。成虫虫体呈微白色，细长粉丝状。口由6个不明显的乳突围绕。雄虫长为12cm～20cm，后部呈螺旋状卷曲，有窄的尾翼膜，末端有尾乳突11对（肛前5对、肛后6对），交合刺2根，长短不等。雌虫长为25cm～30cm，尾端钝圆，阴门开口于食道后端，参见附录B。4PCR检测4.1设备和器材4.1.1移液器（10μL、200μL、1000μL各一支）。 SN/T 3505-20134.1.2 PCR 仪。4.1.3水平电泳槽。4.1.4 pH计。4.1.5电子天平。4.1.6冷冻离心机。4.1.7凝胶成像分析系统。4.1.8电泳仪。4.2试剂和材料4.2.1市售总DNA抽提试剂盒。4.2.2引物：DIDR-F1 5′-AGTGCGAATTGCAGACGCATTGAG-3′;DIDR-R1 5-AGCGGGTAATCACGACTGA GTTGA-3。4.2.3市售PCR缓冲液（含Mg²+、Taq聚合酶等）。4.2.4 DL2000 DNA Marker。4.2.5阳性对照品（恶丝虫阳性犬血浆）。4.2.6阴性对照品（恶丝虫阴性犬血浆）。4.2.7琼脂糖。4.3操作方法4.3.1DNA抽提采集疑似病犬的血液，取1.0mL用总DNA试剂盒抽提血液中的DNA，操作步骤按照试剂盒说明书。DNA溶解于20μL灭菌水中备用。4.3.2扩增和检测25μL扩增体系含：2×PCR缓冲液12.5μL，引物DIDR-F1（10pmol/μL）、DIDR-R1(10pmol/μL)各1.0μL，血液总DNA1.0μL,HzO10.5μL，混匀后稍加离心。按参数：95℃预变性5min；35个循环：95℃变性30s，60℃复性30s，72℃延伸30s；最后72℃延伸10min进行扩增。同时，以H2O代替模板DNA作空白对照。每次试验加做阴性、阳性质控对照。反应结束后，取5.0μI.PCR扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳（10V/cm，30min）。4.4结果分析若PCR产物出现约520bp的目的片段，则对目的产物进行测序，序列应与GenBank中犬恶丝虫参考序列匹配率不小于93%。PCR产物参考序列参见附录C。5抗体检测（Dot-ELISA法）5.1设备和器材5.1.1恒温培养箱。5.1.2硝酸纤维素膜（NC膜）。2 . SN/T3505—20135.1.3玻璃研钵。5.1.4显微镜。5.1.5一次性滤器（0.2