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ICS 65.020B 15NY中华人民共和国农业行业标准NY/T 2059—2011灰飞虱携带水稻条纹病毒检测技术免疫斑点法Technical specification for the detection of rice stripe virus in smallbrown planthopper-Dot immunobinding assay2011-09-01发布2011-12-01实施中华人民共和国农业部-发布
NY/T言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由中华人民共和国农业部种植业管理司提出并归口。本标准起草单位:江苏省农业科学院植物保护研究所。本标准主要起草人:周益军、周彤、范永坚、程兆榜。I
NY/T2059—2011灰飞虱携带水稻条纹病毒检测技术免疫斑点法1范围本标准规定了灰飞虱携带水稻条纹免疫斑点检测方法。本标准适用于灰飞虱携带水稻条纹病毒的检测。2原理硝酸纤维素膜在中性条件下有效地吸附生物大分子,将抗原吸附于硝酸纤维素膜后,进行抗原抗体反应,当抗体与膜上的抗原结合后,通过再次结合有标记的抗抗体,经底物作用使斑点着色。3试剂除非另有说明,均使用分析纯试剂,水为蒸馏水。3.1碳酸钠(Na2CO3)3.2碳酸氢钠(NaHCOs)3.3氯化钠(NaCI)3.4氯化钾(KCI)3.5石磷酸二氢钾(KH2PO4)3.6磷酸氢二钠(Na2HPO)3.7盐酸(HCI)3.8无水乙醇(EaOH)3.9过氧化氢(H202)3.104-氯-1-萘酚3. 11吐温20(Tween-20)3.12脱脂奶粉3.13小牛血清蛋白(BSA)3.14辣根过氧化物酶3.15磷酸盐缓冲液(0.02mo1/L):准确称取40.00g氯化钠(3.3)、1.00g氯化钾(3.4)、1.00g磷酸二氢钾(3.5)和15.00g磷酸氢二钠(3.6)于2500mL的容量瓶中加水定容至刻度,用盐酸(3.7)调节pH至7.5,4℃保存:3.16磷酸盐吐温20缓冲液(0.01mo1/L):准确称取40.00g氯化钠(3.3),1.00g氯化钾(3.4)、1.00g磷酸二氢钾(3.5)和15.00g15.00g磷酸氢二钠(3.6)于5000mL的容量瓶中加水定容至刻度,用盐酸(3.7)调节pH至7.5,再加人2.5mL吐温20(3.11),4℃保存。3.17包被缓冲液(0.05mol/L):准确称取1.59g碳酸钠(3.1)和2.93g碳酸氢钠(3.2)于1000mL的容量瓶中加水定容至刻度,用盐酸(3.7)调节pH至9.6,4℃保存。3.181%脱脂奶粉封闭液:准确称取1.00g脱脂奶粉(3.12)加入100mL磷酸盐吐温20缓冲液(3.16),混匀后4℃保存。3.192%小牛血清蛋白封闭液:准确称取0.2g小牛血清蛋白(3.13)加100mL磷酸盐吐温20缓冲液(3.16),混匀后4℃保存。1
NY/T 2059--20113.20辣根过氧化物酶固体显色底物溶液:准确称取6.00mg4-氯-1-萘酚(3.10),于2mL无水乙醇(3.8)中,4℃保存备用,使用时加入10mL磷酸盐缓冲液(3.15),再加人10μL过氧化氢(3.9)。3.21单抗:效价为1:10000,-18℃保存。3.22二抗:效价为1:5000,一18℃保存。4仪器设备4.1台式离心机。4.2加盖塑料离心管:200μL。4.3恒温摇床。4.4玻璃培养皿。4.5塑料盒:长100mm、宽50mm、高度10mm~50mm。4.6硝酸纤维素膜。5标准程序5.1灰飞虱的准备选择2龄以上单头灰飞虱置于离心管中,用牙签捣碎后加100μL包被缓冲液,离心(5000r/min)3min,取上清液(灰飞虱提取液)备用。5.2封闭预先用铅笔将硝酸纤维素膜划成5mm×5mm的正方格,取3uL灰飞虱提取液点于硝酸纤维素膜中央(以不超出正方格一半为准),同时取3L提纯的水稻条纹病毒(也可用已采用本方法测定为阳性的带毒灰飞虱提取液)和3μL的蒸馏水分别点于硝酸纤维素膜上预先标记好的正方格内,分别作为阳性对照和阴性对照,室温晾干膜。将干燥的膜置于塑料盒或玻璃培养血中,再加入1%脱脂奶粉或2%小牛血清蛋白封闭液至膜完全浸没,于37℃摇床上摇晃30min。5.3孵育将水稻条纹病毒单克隆抗体和封闭液按比例(1:20000~1:40000)配制孵育液,弃去封闭液后将膜完全浸人孵育液,于37℃摇床上孵育1h~1.5h,弃去孵育液,再加人磷酸盐Tween-20缓冲液(3.16),将膜完全浸没于摇床上摇晃3min~5min,倒弃洗液,并重复洗膜3次。5.4二抗孵育倒弃洗液,以辣根过氧化物酶(3.14)标记的二抗和封闭液按比例(1:2500)配制孵育液,将膜完全浸人二抗孵育液,于37℃摇床上孵育
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