SN_T 3895-2014转基因亚麻籽FP967品系实时荧光PCR检测方法.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3895--2014转基因亚麻籽FP967品系实时荧光PCR检测方法Real-time fluorescence PCR method for detection of genetically modifiedcomponents in triffid flax(Event FP967)2014-08-01实施2014-0113发布中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 3895—2014前言本标准按照GB/T1.1---2009给出的规则起草。本标准参考了 EU-CRL 的NOST-Spec construct-specific method for the detection of CDC triffidflax （Event FP967) using real-time PCR方法。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局。本标准主要起草人：曹际娟、张莹、王金玲、徐君怡、贾金生。1 SN/T 3895—2014转基因亚麻籽FP967品系实时荧光PCR检测方法1范围本标准规定了转基因亚麻籽FP967品系（又称作 CDC Triffid)检测的实时荧光 PCR方法。本标准适用于转基因亚麻籽 FP967 品系（又称作 CDC Triffid)的定性检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求GB/T19495.3转基因产品检测核酸提取纯化方法3术语、定义和缩略语3.1术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1.1转基因transgene将物种本身不具有的、来源于其他物种的功能DNA序列，通过各种导入手段，使其在该物种中进行表达，以便该物种获得新的品种特征。3.1.2内源基因endogenous gene在栽培的物种中拷贝数恒定的、不显示等位基因变化的基因。该基因可用于对基因组中某一目的基因的分析。3.2缩略语下列缩略语适用于本文件。Ct值：C:Cycle,tthreshold，每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。DNA:deoxyribonucleic acid,脱氧核糖核酸。dNTP:deoxyribonucleoside triphosphate,脱氧核苷三磷酸。EDTA:ethylene diaminetetraacetic acid,乙二胺四乙酸。NOST-Spec:NOS terminator and spectinomycin resistance gene,NOS 终止子-奇放线菌素抗性基因。奇放线菌素抗性基因是 FP967品系转基因亚麻籽独有基因，目前未在其他任何转基因作物中使用。PCR:polymerase chain reaction,简称 PCR。SAD:stearoyl-acyl carrier protein desaturase,硬脂酰-酰基载体蛋白脱饱和酶。Tris:tris（hydroxymethyl）aminomethane,三（羟甲基)氨基甲烷。1 SN/T 3895—2014TE:Tris-HCI、EDTA 缓冲液。Taq 酶:DNA 聚合酶。UNG酶:uracil-N-glycosylase,尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG)酶。4 主要仪器4.1实时荧光定量 PCR 仪。4.2核酸蛋白分析仪。4.3微量进样器(0.5 μL,2 μL,10 μL,20 μL,100 μL,200 μL,1 000 μL)。4.4高速冷冻离心机。4.5纯水器或双蒸水器。5试剂和材料除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。5.1实验用水：应符合GB/T6682中一级水规格。5.2PCR缓冲液。5.3氯化镁（MgCl²）。5.4dNTPs(dATP,dTTP,dCTP,dGTP,dUTP)。5.5 UNG 酶(Uracil N-glycosylase)。5.6Taq 酶。5.7CTAB 裂解液:3% CTAB（质量浓度）,1.4 mol/L NaCl,0.2%（体积分数)巯基乙醇,20 mmol/L EDTA,100 mmo1/L Tris-HCl,pH 三氯甲烷。5.9戊醇。5.10 丙醇。5.1170%乙醇。5.12TE:1 mmol/L EDTA,10 mmol/L Tris-HCl,pH 3引物和探针。FP967品系转基因亚麻籽成分实时荧光PCR检测所用引物和探针序列见表1。表 1实时荧光 PCR 实验所用引物和探针序列探针序列基因或品系名称引