SN 1559.2-2005非洲猪瘟间接免疫荧光试验操作规程.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1559.2--2005非洲猪瘟间接免疫荧光试验操作规程Protocol of indirect immunofluorescent assay for African swine fever2005-02-17发布2005-07-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局数码防伪 SN/T 1559.22005前 言本标准参照了国际动物卫生组织（OIE)公布的《诊断试验和疫苗标准手册》（2004年版）关于非洲猪瘟诊断中的间接免疫荧光抗体试验方法。本标准的附录 A为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国广东出人境检验检疫局负责起草。本标准主要起草人：刘中勇、周仲芳、许如苏、游洪。本标准系首次发布的出人境检验检疫行业标准。1 SN/T 1559.2—2005非洲猪瘟间接免疫荧光试验操作规程1 范围本标准规定了间接免疫荧光试验检测非洲猪瘟抗体的方法。本标推适用于非洲猪瘟抗体的检测。2仪器设备2.1荧光显微镜。2.2倒置显微镜。2.3二氧化碳培养箱和普通恒温培养箱。2.4 冰箱。3试验材料3.1 非洲猪瘟标准毒株。3. 2 非洲猪瘟标准阴性血清和阳性血清。3.3抗猪荧光抗体。3.4PK-15 细胞(猪肾细胞)或 Vero 细胞(非洲绿猴肾细胞)。3.5胎牛血清。3.6被检血清:56℃灭活30 min。3.7蒸馏水(pH 7.4)，配制方法参见附录A。3.8细胞基础培养液、细胞生长培养液和细胞维持液，配制方法参见附录A。3.90.01mol/LpH7.4PBS(磷酸盐缓冲液），配制方法参见附录A。3.10缓冲甘油：使用中性无自发荧光的甘油（分析纯)配制，配制方法参见附录A。3. 11丙酮：使用前置冰箱预冷。4操作方法4.1 病毒培养用细胞生长液培养PK-15 细胞或Vero 细胞，待细胞长成单层后，弃去培养液，加入非洲猪瘟标准毒株，使病毒液刚好完全覆盖细胞。于37℃5%二氧化碳培养箱中吸附0.5h～2h，弃去病毒液，换以新鲜的细胞维持液，置于37℃5%二氧化碳培养箱内培养，逐日观察,待50%以上细胞出现CPE(细胞病变)时收获。同时培养未感染病毒的细胞，供对照使用。4.2制备抗原片将收获的非洲猪瘟病毒感染细胞配制成浓度为5×105 /mL的细胞悬液，滴2～3滴于载玻片上，涂成均匀薄片，室温下自然风干，用预冷丙酮固定10 min后，制成抗原片。置一20℃保存。4.3制备细胞对照片将长成细胞单层的PK-15细胞或Vero细胞按4.2的方法制备细胞对照片。4.4加样用PBS将被检血清作1：10稀释后，取适量加于抗原片和细胞对照片上，分别制成待检标本和细胞对照标本。将标本放人湿盒内，置于37℃恒温培养箱内温育1h。1 SN/T 1559.2—2005各取1块抗原片和细胞对照片，滴加工作浓度的非洲猪瘟病毒标准阳性血清，制成阳性对照标本。另取抗原片和细胞对照片各1片，滴加工作浓度的非洲猪瘟病毒标准阴性血清，制成阴性对照标本。4.5漂洗用PBS分别标本各3次，每次5min。最后用蒸馏水漂洗3min。4.6加抗猪荧光抗体取出标本，沥干水分,分别滴加工作浓度的抗猪荧光抗体。将标本放人湿盒，置于37℃恒温培养箱内温育1 h。4.7漂洗重复步骤4.5操作，自然风于。4.8镜检在标本上分别滴加缓冲甘油1滴，置荧光显微镜下观察。5结果判定当阳性对照标本的细胞胞浆出现荧光，而阴性对照标本和细胞对照标本的细胞胞浆无荧光时,对照成立，可进行结果判定。细胞胞浆出现荧光的被检标本判为阳性。细胞胞浆无荧光的被检标本判为阴性。2 SN/T 1559.2—2005附录A(资料性附录)试剂配制A.1pH7.4蒸馏水用盐酸或氢氧化钠调蒸馏水的pH值。A.2细胞基础培养液MEM10.00 g2.20 g碳酸氢钠（NaHCO:）加双蒸水至1 000 mL用0.22微孔滤膜过滤除菌，分装，于4℃保存备用。A.3细胞生长培养液于细胞基础培养液中加人10%胎牛血清即成细胞生长培养液。A.4细胞维持液在细胞基础培养液中加人5%胎牛血清即成细胞维持液。A.50.01 mol/L pH 7.4 PBS(磷酸盐缓冲液)磷酸二氢钾(KH,PO）0.26 g磷酸氢二钠(Na²HPO·12H²O)2.89 g氯化钠(NaCl)8.50 g加蒸馏水至1 000 mLA.6 缓冲甘油甘油(分析纯)9 mL1 mL0. 01 mol/L pH 7. 4 PBS 中华人民共和国出人境检验检疫行业标准非洲猪瘟间接免疫荧光试验操作规程SN/T 1559. 2--2005*中国标准出版社出版发行北京复兴门外三里河北街16号邮政编码：100045网址 电话：6852394668517548中国标准出版社秦皇岛印刷