SN_T 4453-2016出口食品中金黄色葡萄球菌的分子分型 SPA基因分型方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 4453—2016出口食品中金黄色葡萄球菌的分子分型SPA基因分型方法Molecular typing method of Staphylococcus aureus in export food-SPA typing method2016-10-01实施2016-03-09发布中华人民共和国O发布国家质量监督检验检疫总局层查真价 SN/T4453—2016前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：深圳市检验检疫科学研究院、中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、中华人民共和国江苏出入境检验检疫局。本标准主要起草人：赵芳、洪小柳、刘慧玲、黄李华、吕敬章、葛丽雅、张恒、马淑棉、黄欣迪、蒋原、薛峰、闫笑梅、张欢。 SN/T4453—2016出口食品中金黄色葡萄球菌的分子分型SPA基因分型方法1 范围本标准规定了金黄色葡萄球菌的SPA基因分型方法。本标准适用于金黄色葡萄球菌的SPA基因分型。规范性引用文件2下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB4789.10食品安全国家标准食品微生物学检验金黄色葡萄球菌检验GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测3缩略语下列缩略语适用于本文件。CTAB十六烷基三甲基溴化铵（HexadecyltrimethylammoniumBromide）DNA脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleicacid)dNTP脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleosidetriphosphate）EDTA乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraaceticacid)PCR聚合酶链反应（polymerasechainreaction）SDS十二烷基硫酸钠（sodiumdodecylsulfate)SPA葡萄球菌A蛋白（Staphylococcus proteinA)Taq酶DNA聚合酶Tris三（羟甲基）氨基甲烷（trishydroxymethylaminomethane）4原理SPA是葡萄球菌细胞壁的一种表面蛋白，绝大多数金黄色葡萄球菌均含有SPA。编码SPA基因的X区包含有2个～15个长21bp27bP的重复序列，该区由于重复序列数目、重复序列特征及重复序列的排列顺序不同而具有高度的多态性。SPA基因的X区具有良好的重复性和体内、体外稳定性，适合用来基因分型。根据SPA基因序列设计引物对X区进行扩增，将扩增产物的测序结果进行比对分析，从而达到分型的目的。5试剂和材料除另有规定外，所有试剂为分析纯或生化试剂。实验用水符合GB/T6682的要求。所有试剂均用1 SN/T 4453—2016无DNA酶污染的容器分装。5.1DNA提取试剂：称取0.1gchelex100粉末，加人100mL灭菌蒸馏水，摇匀即可。5.2RNase（核糖核酸酶）溶液（20mg/mL）。5.3葡萄球菌溶菌酶溶液（1mg/mL）。5.4 TE缓冲液:10 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0),1 mmol/LEDTA(pH 8.0)。5.5蛋白酶k溶液（25mg/mL）。5.6 NaCl(氯化钠)溶液(5 mol/L)。5.7三氯甲烷（氯仿）。5.8酚。5.9异戊醇。5.10异丙醇。5.1110XPCR缓冲液：200mmol/LTris-HClpH8.0）,200mmol/L氯化钾。5.12琼脂糖。5.13DNA分子量标记物(100 bp~1000bp)。5.14血琼脂平板：见A.3。5.15CTAB-NaCI溶液:见 A.1。5.16无菌生理盐水：见A.2。6仪器和设备6.11PCR 仪。6.2 DNA 测序仪。6.3 电泳装置。6.4 凝胶成像系统。6.5 电热仪。6.6离心机：离心力不小于12000g。6.7恒温培养箱：36℃士2℃。6.8移液器：2μL~10μL、10μL~100μL、20μL~200μL、100μL~1000μL。7 检测步骤7.1样品制备、增菌培养和分离样品的制备、增菌培养和分离步骤参照GB4789.10方法进行。7.2模版 DNA 的制备7.2.1直接提取法金黄色葡萄球菌经培养后，取增菌液1mL,加到1.5mL无菌离心管中，13000r/min离心5min，吸弃上清；加人50μLDNA提取液，混匀后沸水浴5min，13000r/min离心5min，取上清保存于一20℃备用以待检