SN 1151.1-2002对虾Taura综合征病毒（TSV）逆转录聚合酶联式反应（RT-PCR）诊断方法.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1151.1—2002对虾Taura综合征病毒(TSV)逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)诊断方法Test method of reverse transcription polymerase chainreaction (RT-PCR) for tuara syndrome virus (TSV)2002-11-25发布2003-05-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 1151. 1--2002前言本标准的附录 A 是资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国深圳出人境检验检疫局。本标准主要起草人：江育林、高隆英、刘、史秀杰。本标准系首次发布的检验检疫行业标准。I SN/T 1151.1—2002对虾 Taura 综合征病毒(TSV)逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)诊断方法1范围本标准规定了用聚合酶链式反应技术检测对虾 Taura 综合征病毒的方法。本标准适用于对虾 Taura综合征病的鉴定及本病的流行病学调查、诊断、检疫和监测。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标推达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标。GB/T6682—1992分析实验室用水规格和试验方法（eqvISO3696：1987)3试剂和材料3.1 水应符合GB/T6682—1992中级水的规格。3.2 Taq酶20℃保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。3.3逆转录酶AMV一20℃保存,不要反复冻融或温度剧烈变化。3. 4 RNA 抑制剂(RNasin)一20℃保存,不要反复冻融或温度刷烈变化。3. 5 dNTP(含 dCTP,dGTPdATPdTTP 各 10 mmol/L)3.6 引物浓度为40 μmol/I。其序列如下：上游引物 TSVF:5-TCA ATG AGA GCT TGG TCC-3下游引物 TSVR:5-AAG TAG ACA GCC GCG CTT-33.7异丙醇分析纯，使用前预冷到一20℃。3.8矿物油要求无 DNA 酶和 RNA 酶。3.9剪刀、镊子4器材和设备4.1 PCR扩增仪4.2电泳仪4.3微量移液器及吸头4.4紫外观察灯4.5恒温培养箱4.6普通冰箱和低温冰箱 SN/T 1151. 120024.7电动匀浆器4.8离心机和离心管5 Taura 综合征病毒核酸的鉴定5.1采样取活虾，或取头部放在95%的酒精中(可以在常温下保存30d)，但样品处理前须让酒精完全挥发。取约 50 mg～100 mg的鳃丝(或者附肢、上皮、血淋巴),放在 1.5 mL 的离心管中。5.2样品处理应在10℃以下进行。先加人150μLCTAB(见附录A.1)溶液，用小剪刀剪碎后，用电搅拌器将样品匀浆成糊状。再加 CTAB溶液到900μL。混匀勾后于25℃作用2 h。5.3RNA抽提在含有样品的离心管中加人600μL抽提液1（见附录A.2），充分混匀30s，12000r/min离心5min，取上层水相（约750μL）。再加入650μL抽提液2（见附录A.3），充分混匀30s，12000r/min离心5min，取上层水相（约600μL）。再加人1.5倍体积的异丙醇（约900μL），倒置数次混勾后，一20℃，8h以上以沉淀核酸，12000/min离心30 s，弃去上清，干燥后加10μL无菌蒸馏水溶解，用作PCR模板。5.4变性和退火在PCR管中加人10μL模板和5uL引物（上游引物和下游引物各2.5μL），置于70℃反应5min，立即冰浴，低速离心约5s使液体集中在底部。5.5 cDNA合成在上述反应管中继续加人 dNTP 2 μL、5倍逆转录酶缓冲液（见附录 A.6)5 μL、RNA 抑制剂(20U)0.5μL、无菌蒸馏水1.5μL，再覆盖50 μL矿物油。将PCR管置于PCR扩增仪中，37C反应10min后，再加人1μL逆转录酶 AMV(20U)并低速离心。42℃ 60 min反应以扩增出模板的cDNA。反应结束后，70℃ 10 min 灭活逆转录酶，立即冰浴。5.6 PCR 扩增 DNA在上述反应管中再继续加人 Taq酶5U,dNTP1μL,反向引物和正向引物各 1μL,25 mmol/L 的氯化镁（MgCl2）（见附录A.7）10μL、10倍Taq酶浓缩缓冲液（见附录A.8)10μL、加水到总体积100 μL.混匀后低速离心，让矿物油在上层。再将反应管置于 PCR扩增仪。先94℃ 4 min→50℃ 1 min72℃ 1 min,再 94℃