NY 675-2003转基因植物及其产品检测 大豆定性PCR方法.pdf

ICS 65. 020. 99B 20NY中华人民共和国农业行业标准NY/T 675—2003转基因植物及其产品检测大豆定性PCR方法Detection of genetically modified plant organisms and derivedproducts-Qualitative PCR methods for soybeans2003-04-01发布2003-05-15实施中华人民共和国农业部发布 中华人民共和国农业行业标转基因植物及其产品检测大豆定性 PCR方法NY/T 675—2003*中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街16号邮政编码；100045电话：6852394668517548中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷新华书店北京发行所发行各地新华书店经售*字数10千字印张 1/2开本 880×12301/162003年5月第一版　2003年5月第一次印刷印数 1-~1 000*网址 www.bzcbs. com侵权必究版权专有举报电话：（010NY/T 675—2003前言本标准由农业部科技教育司提出。本标准起草单位：中国农业大学、上海市农业科学院、中国农业科学院生物技术所、农业部科技发展中心。本标准主要起草人：罗云波、黄昆仑、张大兵、贾士荣、彭于发、金芜军、李宁、汪其怀。本标准首次发布。 NY/T 675-2003转基因植物及其产品检测大豆定性PCR方法1范围本标准规定了转基因大豆及其产品的定性PCR检测方法。本标准适用于转基因抗草甘麟大豆及其产品、转基因抗草丁麟大豆及其产品、转基因高油酸大豆及其产品，包括大豆种子、大豆、豆粕、大豆粉、大豆油及其他大豆制品中转基因成分的定性PCR检测。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适合于本标准。NY/T672转基因植物及其产品检测通用要求NY/T674转基因植物及其产品检测DNA提取和纯化3原理针对转基因抗草甘麟大豆(GTS40-3-2)含有的CaMV35S启动子、nos终止子、矮牵牛花的CTP4、Cp4-epsps 基因以及大豆内标准基因 lectin,设计特异性引物进行 PCR 扩增，以检测试样中是否含有转基因抗草甘麟大豆的成分。转基因抗草丁麟大豆和转基因高油酸大豆含有共同的元件CaMV35S 启动子基因以及内标准基因 lectin，用上述的引物进行 PCR扩增以检测试样中是否含有转基因抗草丁麟大豆和转基因高油酸大豆的成分。4试剂与材料除非另有说明，在分析中仅使用分析纯试剂；配制好的溶液经高温灭菌后使用。4.1各10 mmol/L的四种脱氧核糖核苷酸(dATP,dCTP,dGTP,dTTP)混合溶液。4.210mol/I氢氧化钠溶液：称取氢氧化钠80g，先用160ml水溶解后，再加水定容到200mL。4.3500 mmol/L乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA)溶液:称取乙二胺四乙酸二钠18.6 g,加人 70 mL水中，再加人10mol/L氢氧化钠溶液，加热溶解后，冷却至室温，再用10mol/L氢氧化钠溶液调pH至8.0,用水定容到100ml，在103.4kPa灭菌20min。4.450×TAE缓冲液：称取Tris242.2g，先用300mL水加热搅拌溶解后，加100mL500mmol/LEDTA的水溶液（pH8.0),用冰乙酸调pH至8.0,然后用水定容到1000mL。4.5’Taq DNA聚合酶(5单位/μL)及10×PCR反应缓冲液（含25mmol/L Mg²+）。4.610mg/mL溴化乙锭溶液。注：溴化乙锭(EB)有致癌作用，使用时要戴一次性手套。4.7 DNA 分子量标记(DNA Molecular Weight Marker)。4.81mol/L Tris-HC(pH 8.0)溶液：称取 121.1g Tris碱溶解于800 mL水中，用浓盐酸调 pH至8.0,用水定容至1 000 mI.,在103.4 kPa灭菌 20 min。4.9 TE缓冲液(pH 8. 0):1 mol/I. Tris-HCl(pH 8. 0)10 mL 和 500 mmol/L EDTA(pH 8. 0)溶液2 mL,用水定容至 1 000 mL。1 NY/T 675--20034.10加样缓冲液：称取溴酚蓝250mg，加水10mL，在室温下过夜溶解；再称取二甲苯腈蓝250mg，用10 mL水溶解；称取蔗糖50 g,用30mL水溶解，合并三种溶液，用水定容至100mL,在 4℃中保存。4.11 引物。4. 11. 1 lectin 基