SN_T 4799-2017动物结核病病原菌检测方法 变性高效液相色谱法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 4799—2017动物结核病病原菌检测方法变性高效液相色谱法Detection of tuberculosis pathogenic organisms of animals-DHPLC method2017-07-21 发布2018-03-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 中华人民共和国出人境检验检疫行业标准动物结核病病原菌检测方法变性高效液相色谱法SN/T 4799—2017*中国标准出版社出版北京市朝阳区和平里西街甲2号（100029)北京市西城区三里河北街16号（100045）总编室：（010址 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷*开本880×12301/16　印张0.75字数18千字2018年6月第一版　2018年6月第一次印刷印数1--500*书号：155066·2-33414 SN/T 4799--2017前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国广东出人境检验检疫局。本标准主要起草人：刘志玲、陈茹、王莹、吴晓薇、朱道中、段燕喻、林志雄， SN/T 4799-2017动物结核病病原菌检测方法变性高效液相色谱法1 范围本标准规定了结核分枝杆菌复合群、结核分枝杆菌、牛分枝杆菌多重PCR联合变性高效液相色谱(mPCR-DHPLC)检测方法的技术要求和操作规范。本标准适用于快速检测细菌培养物、动物组织、血样、痰液等临床样品中结核分枝杆菌复合群、结核分枝杆菌、牛分枝杆菌。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB19489实验室生物安全通用要求3缩略语下列缩略语适用于本文件。DHPLC:变性高效液相色谱(denaturing high-performance liquid chromatography)。dNTP:脱氧核苷三磷酸（deoxyribonuclesosde triphosphate）。PBS:磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution)。mPCR:多重聚合酶链式反应(multiplex-polymerase chain reaction)。TEAA:三乙基铵醋酸盐。4概述人与动物结核病涉及多种病原菌或病原菌复合群。结核分枝杆菌复合群（Mycobacterium tuber-culosis complex，MTC)是感染人与哺乳动物的结核病原菌，包括结核分枝杆菌和牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌和田鼠分枝杆菌。其中，主要感染人与家畜并致病的是结核分枝杆菌和牛分枝杆菌。与 MTC相对应的是种类繁多的各种非结核分枝杆菌(NTM)。NTM 感染患者的临床症状及病理变化与 MTC引起的结核病极为相似,但多数 NTM对抗结核药物有天然耐药性。此外，NTM 感染可造成结核菌素皮内变态反应或血清学检测假阳性。采用多重PCR联合变性高效液相色谱检测的方法可同步区分结核分枝杆菌复合群与非结核分枝杆菌复核群，并鉴别结核分枝杆菌与牛分枝杆菌mPCR反应的原理、操作过程与普通 PCR 相同。在同一PCR反应体系里加人多对特异性引物,对多个 DNA模板或同一模版不同区域扩增出多个目的 DNA 片段。DHPLC分析技术是利用液相色谱技术,在高压闭合液相流路中,将 DNA样品自动注入并在缓冲液携带下流过 DNA 分离柱,DNA片段分子中带负电荷的磷酸根基团与TEAA分子中带正电荷的氨基发生静电作用相互吸引，同时TEAA分子中的三个乙基与固定相C18表面的烷基发生疏水作用力而相互吸引，通过流动相中的乙腈的梯度洗脱将不同大小的 DNA片段分离。由紫外或荧光检测被分离的 DNA样品。根据 DNA 扩增片段长1 SN/T 4799—2017度大小，不同分子量的特异扩增产物在特定位置呈现吸收峰，从而对结核分枝杆菌复合群、结核分枝杆菌和牛分枝杆菌进行快速检测。5材料与试剂5.1仪器与耗材5.1.1变性高效液相色谱分析仪。5.1.2核酸扩增仪。5.1.3Ⅱ级生物安全柜。5.1.4接种棒。5.1.5恒温水浴锅（室温至100℃）。5.1.6离心机。5.1.7微量可调移液器和灭菌吸头:10 μL、100 μL、200 μL、1000 μL。5.1.8天平。5.1.9PCR光学反应管。5.2试剂5.2.1试剂级别：除另有规定，所用化学试剂均为分析纯。5.2.2检测用引物：见表1。表 1分枝杆菌 PCR-DHPLC 检测扩增引物序列目标菌类目标基因核酸序列（5—3）产物大小上游引物:CCAACAAGAAGGCGTACTC结核分枝杆IS6110165