QB_T 4356-2012黄酒中游离氨基酸的测定 高效液相色谱法.pdf

ICS 67.160.10QB分类号：X62备案号：37974-2013中华人民共和国轻工行业标准QB/T 4356—2012黄酒中游离氨基酸的测定高效液相色谱法Determination of free amino acids in Chinese rice wineHigh performance liquid chromatography2013-03-01实施2012-11-07 发布发布中华人民共和国工业和信息化部 QB/T 4356 - 2012前言本标准按GB/T1.1~2009给出的规则起草本标准由全国食品发酵标准化中心提出并归口。本标准起草单位：中国食品发酵工业研究院、上海金枫酒业股份有限公司、浙江古越龙山绍兴酒股份有限公司、中粮绍兴酒有限公司、苏州华测生物技术有限公司。本标准主要起草人：钟其顶、熊正河、傅建伟、胡健、邹慧君、方逸群、吕兴龙、金建江、郭冰、高红波。一 QB/T 4356—2012黄酒中游离氨基酸的测定高效液相色谱法1范围本标准规定了异硫氰酸苯酯（PITC）柱前衍生高效液相色谱测定黄酒游离氨基酸的方法。本标准适用于黄酒中天冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）、丝氨酸（Ser）、甘氨酸（Gly）、组氨酸（His）、精氨酸（Arg）、-氨基丁酸（Gaba）、苏氨酸（Thr）、丙氨酸（Ala）、脯氨酸（Pro）、酪氨酸（Tyr）、缬氨酸（Val）、蛋氨酸（Met）、异亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、苯丙氨酸（Phe）、色氨酸（Trp）、赖氨酸（Lys）共18种游离氨基酸测定，氨基酸检出限为1.0mg/L。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规则和实验方法3原理采用异硫氰酸苯酯衍生剂与黄酒中游离氨基酸进行衍生反应，氨基酸衍生产物在特定紫外波长有强吸收，经色谱柱分离后，紫外检测器检测，外标法定量分析。4　试剂除另有说明外，所有试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。4.1乙腈：色谱纯。4.2异硫氰酸苯酯（不小于98%）。4.3三乙胺：分析纯。4.4无水乙酸钠。4.5正已烷。4.6冰乙酸（不小于99.0%）。4.7浓盐酸。4.8异硫氰酸苯酯的乙腈溶液：移取0.12mL异硫氰酸苯酯至10mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度混匀。4. 9三乙胺-乙溶液：移取1.40mL三乙胺至10 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，混匀。20%（体积比）乙酸溶液：取2mL冰乙酸至10mL容量瓶中，用水定容至刻度，混匀。4.1024.110.1mol/L 盐酸溶液：取0.90mL浓盐酸至100 mL容量瓶中，用水定容至刻度，混匀。4.12氨基酸标准物质(具体名称见附录A)：纯度不小于98%。4.13标准储备液：准确称取一定质量的各氨基酸标准品，用0.1mol/L盐酸溶解，混匀，使其浓度为0.50mg/mL，配制的标准储备液在4℃冰箱保存，有效期3个月。4.14标准工作液：准确量取标准储备液，用水稀释，依次配制成10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、80μg/mL 的标准溶液。5仪器和材料5.1高效液相色谱仪：配有紫外检测器或二极管阵列检测器。5.2分析天平（精度0.1mg）。\ QB/T 4356—20125.3 涡旋混合器。5.4带塞试管。5.5微孔滤膜：孔径0.45μm（有机系和水系）。6　分析步骤6.1样品衍生准确吸取黄酒样品1.0mL，于10mL容量瓶中，用水定容至刻度，混匀，取500μL稀释后的酒样，置于带塞试管中，加入异硫氰酸苯酯的乙腈溶液（4.8）250μL、三乙胺-乙腈溶液（4.9）250μL，混匀，室温下放置1h后，加入50μL乙酸溶液（4.10），混匀。6.2萃取净化向上述衍生后的溶液中加入1.0mL正已烷（4.5），涡旋混合器振荡1min，静置分层后，弃去上层正已烷溶液，采用针头注射器小心吸取下层溶液，经0.45μm有机系滤膜过滤，：用于液相色谱测定。6.3标准工作液衍生分别移取500μuL系列标准工作液（4.14），置于带塞试管(5:4)中，加入异硫氰酸苯酯的乙腈溶液（4.8）250 μL、丰乙胺-乙溶液（4.9）250μL，混匀，室温下放置1h后，加入50uL乙酸溶液（4.10），混匀按6.2进行萃取净化。6.4参考色谱条件6.4.1色谱柱：Cg色谱柱（250mm×4.6mm，5μm）或等效色谱柱。6.4.2流动相A：称取1.64g无水乙酸钠（4.4），加适量水溶解，加入0.5mL三乙胺（4.3），用水定容至1000mL，用20%乙酸溶液（4.10）调pH至6.20，0.45μm水系滤膜过滤。流动相B：乙腈＋水=8十2（体积比