SNT 1840-2006植物病毒免疫电镜检测方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T物病毒免疫电镜检测方法Method for detection of plant viruses by immuno-electron microscopy2006-11-10 发布2007-05-16 实施中华人民共和国活除显拨酶期著查油项(体发布数码防伪国家质量监督检验检疫总局 SN/T 1840--2006前言本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准负责起草单位：中华人民共和国深圳出入境检验检疫局。本标准主要起草人：陈枝楠、郑耘、邓琼、王伍、顾光昊。本标准系首次发布的检验检疫行业标准。 SN/T 1840--2006植物病毒免疫电镜检测方法1范围本标准规定了植物检疫中对植物病毒的免疫电镜检测方法。本标准适用于植物种子、苗木等繁殖材料和植物产品中植物病毒的免疫电镜检测。2原理免疫电镜(Immuno-electron microscopy,IEM)是免疫学原理与电镜负染技术相结合的方法。通过包被在铜网上的抗体从含有病毒的植物组织粗提液中特异地、高效地捕捉病毒粒体，经乙酸铀染色，在透射电子显微镜下可以清晰观察到病毒粒体形态结构及其外部的抗体晕圈，为在超微结构水平下对植物病毒进行鉴定提供了抗原形状和血清学特性的信息。3仪器设备和用具3.1微量榨汁机。3.2高速冷冻离心机。3.3植物光照培养箱（温度可调范围0℃～50℃）。3.4　电子分析天平（感量：0.001g)。3.5pH计(测量精度：士0.05pH)。3.6透射电子显微镜（放大倍数：20万倍）。3.7研钵、离心管（1.5 mL）、铜网（400 目）、滴管、尖头小镊子、Whatman 滤纸、塑料培养Ⅲ、洁净玻璃片,Parafilm。4试剂及溶液4.1样品提取缓冲液将 50 mL 0.1 mol/L Tris碱溶液与17.2 mL 的0.1 mol/L盐酸(HCl)混合,再加人蔗糖13.68g和氯化钠(NaCl)0.88g，用灭菌蒸馏水定容至100mL，配制成0.05mol/LTris-HCl(pH8.4)样品提取缓冲液。4.2Tris-HCl 缓冲液将 50 mL 0.1 mol/L Tris碱溶液与 44.7 mL的 0.1 mol/L 盐酸(HCl)混合，用灭菌蒸馏水定容至100 mL，配制成浓度为 0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.2）。4.3磷酸缓冲液将浓度为 1 mol/L 的磷酸氢二钠（Naz2HPO）溶液 57.7 mL 和浓度为 1 mol/L 磷酸二氢钠(NaHzPO4）溶液42.3mL均匀混合，加人灭菌蒸馏水定容至1000mL，配制成0.1mol/L磷酸缓冲液母液（pH7.0）。使用时，将上述母液用灭菌蒸馏水稀释5倍，配制成0.02 mol/L磷酸缓冲液（pH7.0），备用。4. 4 Formvar 膜将聚乙烯醇缩甲醛溶于三氯甲烷，配成0.25%溶液，贮存于冰箱内备用。制膜时取块洁净的玻璃片插人溶液中，取出倾斜放置，待三氯甲烷挥发后，在玻璃片上形成一层薄膜，用镊尖沿玻璃边缘划破薄膜，再将玻璃片倾斜浸人灭菌蒸馏水中，薄膜即从玻璃片上脱落下来漂浮于水面，取洁净的铜网光面向下轻轻地摆放在上面，压紧，再用一块Parafilm覆盖其上，捞起后置于培养Ⅲ内，干燥备用。 SN/T 1840—20064.5乙酸铀染色液称取0.5g乙酸双氧铀，溶于灭菌蒸馏水中，定容至25mL，配制成2%乙酸铀染色液，置于4℃冰箱中备用。乙酸铀染色液最好使用前配制。4.6种子表面消毒液配制3%次氯酸钠消毒液。4.7免疫学检测试剂可采用商品化的待检测病毒的抗血清(包括阳性对照和阴性对照）。5免疫电镜检测鉴定5.1样品制备5.1.1种子类在实验室检测样品中，随机抽取或针对性挑选100粒种子，经种子表面消毒液消毒10 min后，用灭菌蒸馏水洗涤三次,将种子置于铺有吸水纸的白瓷盘中，分五组将种子分列其中，放于植物光照培养箱内在适宜的发芽温度条件下（20℃～28℃）催芽，然后移栽至花盆中培养,待长出第3片～4片真叶时，观察是否表现相关病毒病症状。采集表现症状植株病叶1~g(适用于外部形状为线状或杆状的植物病毒），按1：3（质量：体积)比例加人样品提取缓冲液，在微量榨汁机或研钵内研磨出汁液分别盛装于离心管（1.5mL）中，制成植物病毒粗提液,每一植株制备一个样品。对于外部形状为球状的植物病毒应增加病叶的使用量（3g～5g），同样按1：3（质量：体积)比例加入样品提取缓冲液，经研磨后制成植物病毒粗提液。如果发现有可疑相关病毒病症状的种子,可在进行表面消毒后，直接用灭菌蒸馏水浸泡种子,待种皮泡软后（约12 h～24h),经研磨制备植物病毒粗提液(方法同上）。5.1.2鳞球(块)茎类20个（头)鳞球茎或块茎芽眼（