SNT 2497.18-2010进出口危险化学品安全试验方法 第18部分：DNA加合物的检测方法.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2497.18—2010进出口危险化学品安全试验方法第 18部分：DNA加合物的检测方法Test method of import and export dangerous chemicals--Part 18:Detection method of DNA adduct2010-03-02发布2010-09-16实施中华人民共和国发布严性数1者查询复方国家质量监督检验检疫总局数码防伪 SN/T 2497.18—2010前言SN/T2497《进出口危险化学品安全试验方法》系列标准共分为29部分：第1部分：体内哺乳动物肝细胞程序外DNA合成(UDS)试验；第2部分：空斑形成细胞(PFC)试验；第3部分：大型遥繁殖试验；第4部分：酿酒酵母有丝分裂重组试验；第5部分：睾丸细胞UDS试验；第6部分：哺乳类动物细胞姐妹染色单体互换体外试验；-第7部分：小鼠耳肿胀试验；第8部分：窝淋巴结试验；第9部分：血清溶血素测定试验；第10部分：T淋巴细胞增殖功能测定试验；第11部分：种系突变试验；第12部分：单细胞凝胶电泳分析试验；第13部分：荧光原位杂交试验；第14部分：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳试验；-第15部分：PCR-SSCP实验；第16部分：Western-Blot实验；第17部分：哺乳动物行为毒理学试验；第18部分：DNA加合物的检测方法；第19部分：Northern Blot实验;第20部分：Bradford法测定蛋白质含量；第21部分：琼脂糖凝胶电泳试验；第22部分:DNA 的 Tm值测定方法；第23部分：细胞器的分离实验方法；第24部分：细胞免疫功能体外检测方法；第25部分：体液免疫功能试验；-第26部分：巨噬细胞功能试验；第27部分：流式细胞术检测凋亡；-第28部分：穿梭质粒在突变检验中的应用；第29部分：生化需氧量(BOD)测定。本部分为SN/T2497系列标准的第18部分。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分负责起草单位：中华人民共和国天津出人境检验检疫局，中华人民共和国湖南出人境检验检疫局。本部分主要起草人：于艳军、王利兵、赵好力宝、赵黎华、韩伟、熊中强。本部分系首次发布的出入境检验检疫行业标准。 SN/T 2497.18—2010进出口危险化学品安全试验方法第18部分：DNA加合物的检测方法1范围SN/T 2497的本部分规定了进出口危险化学品DNA加合物检测方法的主要试剂和材料、主要仪器设备、试验步骤和试验结果。本部分适用于32P后标记法检测进出口危险化学品引起的DNA加合物。2术语、定义和缩略语2.1术语和定义下列术语和定义适用于本部分。2.1.1DNA 加合物DNA adductDNA加合物就是亲电性的化合物或其代谢产物与DNA形成共价相联的化合物，是DNA化学损伤的主要形式之一2.2缩略语下列缩略语适用于本部分。2.2.1DNA 脱氧核糖核酸3原理含有加合物的 DNA链在核酸内、外切酶的作用下降解为3单磷酸核苷,用核酸酶(P1 或 S1)处理3单磷酸核苷，正常的3单磷酸核苷被去磷酸化，而具有加合物的3单磷酸核苷可以抵抗这一作用。在特异的T4 多核苷酸激酶的作用下,3²P-ATP的磷酸根基团转移到具有加合物的核苷酸的5羟基末端，形成3-5二磷酸核苷，通过检测3²P-ATP的量对DNA损伤产生的加合物进行定量。4主要试剂和材料除另有规定外，所有试剂均为分析纯，实验用水为灭菌蒸馏水或超纯水。4.1 内切酶。4.2外切酶。4.3 P1 核酸酶。4. 4 32P-ATP。4.5 T4 多核苷酸激酶。4.6T4 多核苷酸激酶缓冲液:0.1 mol/L Bicine-NaOH,0.1 mol/L MgCl²,0.1 mol/L 二硫化苏糖醇,10 mmol/L精,pH 值 9.5。4.7ODS-TLC板（反相吸附薄层色谱板）。4.8　PEI-TLC板（阴离子交换薄层色谱板）。5主要仪器设备5.1紫外分光光度计。 SN/T 2497.18—20105.2液闪计数仪。6试验步骤6.1 DNA的消化取(6～10)μgDNA溶解液,加人适当内切酶、外切酶和缓冲液，置于 37℃水浴(2～4)h，然后加入适量 P1 核酸酶,继续孵育 40 min。6.2同位素标记在 T4多核苷酸激酶催化下加约100 μCi左右的3²P-ATP,在 T4多核苷酸激酶缓冲液存在下 37℃反应 30 min,然后加人1 μL 腺苷三磷酸双酶继续孵育 30 min，以水解多余的3²P-ATP。6.3加合物的分离利用DNA加合物和DNA水解物色谱性能的差异，将样品点在 ODS-TLC 板上，分离加合物和正常核酸,还可选用 PEI-TLC板分离不同的加合物。6.4DNA 加合物的定量根据放射自显影DNA加