SNT 2472-2010日本乙型脑炎检疫技术规范.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2472—2010日本乙型脑炎检疫技术规范Protocol of quarantine technique for Japanese encephalitis2010-01-10 发布2010-07-16 实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局涂层拨5105615号查数码防伪 SN/T 2472-2010次目前言范围1规范性引用文件23概述..诊断技术415综合判定·516试剂配制附录A（规范性附录)19附录B（规范性附录），感染乳鼠脑组织制备血凝素抗原 SN/T 2472—2010言前本标准的附录 A、附录 B均为规范性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准的起草单位：中华人民共和国吉林出人境检验检疫局、中华人民共和国上海出人境检验检疫局。本标准主要起草人：石建平、孟日增、肖成蕊、王伟利、李树清。本标准系首次发布的出人境检验检疫行业标准。 SN/T 2472--2010日本乙型脑炎检疫技术规范1范围本标准规定了日本乙型脑炎病毒的分离与鉴定、RT-PCR方法、乳胶凝集试验、间接免疫荧光试验、蚀斑减数试验、血凝抑制试验、补体结合试验等实验室检疫技术规范。本标准适用于马属动物和猪日本乙型脑炎的诊断与检疫。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为该标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3概述日本乙型脑炎(Janpanese encephalitis)又名流行性乙型脑炎，简称乙脑，是由日本乙型脑炎病毒引起的一种急性人兽共患传染病。蚊虫为传播媒介。在人和马呈现脑炎症状，猪表现流产、死胎和睾丸炎，其他家畜和家禽大多呈隐性感染。有明显的季节性。本病分布很广，主要存在亚洲地区，给人畜健康和国民经济造成很大的危害和损失。引起本病的病原体为日本乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus)属于黄病毒科（Flaviviridae）、黄病毒属（Flavivirus），是一种球形单股 RNA病毒,病毒粒子呈球形,有脂蛋白的囊膜,囊膜上有纤突，具有血凝活性，能凝集鸡、鸭、鹅及绵羊红细胞。病毒对外界抵抗力不强，对化学药品较敏感，常用消毒药都有良好的灭活作用,对胰酶、乙醚、三氯甲烷等亦敏感。小鼠是最常用来分离和繁殖病毒的实验动物，各种日龄的小鼠都有感受性，但以1日龄～3日龄的乳鼠最易感。小鼠脑内接种病料后经 2 d～4 d开始发病，表现松毛，失去光泽并于 1 d～2 d内死亡。3～4周龄的小鼠经脑接种后 4 d～10 d发病。大鼠亦可感染发病。豚鼠、兔、鸡都不易感。病毒最适宜在鸡胚卵黄囊内繁殖,此外病毒亦可在鸡胚成纤维细胞、猪肾或仓鼠肾细胞、Vero 细胞、MDBK 细胞和蚊细胞上增殖，并产生细胞病变和形成空斑,故可用来繁殖和滴定病毒。日本乙型脑炎的诊断方法包括临床综合诊断,病原学诊断和血清学试验。进行病毒分离与鉴定时，要求所有样品处理应于可保证生物安全的相应级别实验室内进行操作；处理样品使用过的容器、物品、实验材料均应经有效消毒处理后方可运离实验室。4诊断技术4.1临床综合诊断日本乙型脑炎在亚热带和温带地区有明显的季节性，流行集中于夏末秋初，呈散发性发生，多发生于幼龄动物，马有明显的脑炎症状，表现沉郁、兴奋、麻痹或沉郁与兴奋交替出现。怀孕母猪发生流产，公猪发生睾丸炎，取死后动物的大脑皮质、丘脑和海马角进行组织学检查，发现非化脓性脑炎变化等，可作为初步诊断依据。1 SN/T 2472—20104.2 病毒分离与鉴定4.2.1材料器材细胞培养瓶（或培养板）、吸管、CO2培养箱、冷冻高速离心机、研磨器、倒置显微镜、G6 玻璃滤器、孔径0.22μm微孔滤膜。4.2. 1.2试剂.1水：符合GB/T 6682所规定的一级水。.2细胞生长液：含1%双抗溶液（终浓度100IU/mL青霉素和100μg/mL链霉素）、10%小牛血清、0.03%谷氨酰胺MEM,用7.5%碳酸氢钠(NaHCO)调节 pH值至7.0～7.2。.3细胞维持液：含1%双抗溶液（终浓度100IU/mL青霉素和100μg/mL链霉素）、2%小牛血清、0.03%谷氨酰胺 MEM,用 7.5%碳酸氢钠(NaHCO.)调节pH值至 7.0～7.2。.40.25%胰酶消化液（见附录A）。.5双抗液（见附录 A）。实验动物乳鼠、6 g～8g小鼠或鸡胚细胞绿猴肾细胞(Vero 细胞)、仓鼠肾细胞(BHK-21)或白纹伊蚊 C6/36 传代细胞等。4.2.2病毒分离培养．样品采集和运送.1样