SN_T 4077-2014齿兰环斑病毒检疫鉴定方法.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 4077—2014齿兰环斑病毒检疫鉴定方法Detection and identification of odontoglossum ringspot virus2015-05-01 实施2014-11-19 发布中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局S SN/T 4077—2014言前 本标准按照GB/T 1.1一2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国厦门出入境检验检疫局、中华人民共和国江苏出人境检验检疫局、厦门市植保植检站。本标准主要起草人：陈青、黄峰、李彬、廖富荣、谢毅璇、陈红运、林石明。1 SN/T 4077--2014齿兰环斑病毒检疫鉴定方法1范围本标准规定了齿兰环斑病毒检疫鉴定的免疫学和分子生物学检测方法。本标准适用于可能带有齿兰环斑病毒的兰花苗及植物产品的检疫鉴定。2齿兰环斑病毒基本信息学名:odontoglossum ringspot virus缩写:ORSV分类地位：烟草花叶病毒属（Tobamovirus）的成员。ORSV主要通过机械性传播，桃蚜能传毒。详细资料参见附录A。3方法原理根据齿兰环斑病毒与抗体之间的特异性反应,对兰花叶片进行 ELISA检测;根据该病毒基因组特性进行PCR特异性检测，通过电泳条带大小进行结果判定。4仪器、设施及试剂4.1仪器与设施酶联检测仪、电子天平（感量0.0001g）、PCR仪、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、恒温水浴、低温冰箱、普通冰箱、离心机等；微量移液器（2.5.μL，10μL，20 μuL，100 μL，200 μl，1000 μL）；酶联板、研钵等;防虫温室。4.2试剂酶联检测试剂（见附录B）,RT-PCR检测试剂（见附录C），IC-RT-PCR检测试剂（见附录D）。5 检疫与鉴定5.1制样观察样品，有症状（如：叶片畸形、花叶、斑驳等）的苗木编号单独检测。没有症状的分组并编号检测，分组，10株为一组，采集的叶片分成两份，分别用于酶联检测和分子生物学检测，不足10株可每株取样进行检测。5.2检测方法5.2.1双抗体夹心酶联免疫吸附检测(DAS-ELISA)把制备的样品上清液加人已包被ORSV抗体的96孔酶联板中，进行DAS-ELISA检测。每个样品1 SN/T 4077—2014平行加到两个孔中。设阴性对照和阳性对照（健康的植物组织作阴性对照，感染了ORSV的植物组织作阳性对照），样品提取缓冲液作空白对照，其中阴性对照种类和材料（叶片)应尽量与检测样品一致。不同的检测试剂或试剂盒根据试剂或试剂盒的说明操作。具体操作见附录B。5.2.2RT-PCR 检测分别提取样品和对照的总RNA，反转录合成cDNA后，进行PCR扩增。健康的植物组织作阴性对照，感染ORSV的植物组织作阳性对照，用超纯水作空白对照。具体操作见附录C。5.2.3IC-RT-PCR 检测将用包被缓冲液稀释好的包被抗体50μL～100μI.包被溶液于0.6mL的离心管中，25℃中放置3h或4℃冰箱中过夜，PBST缓冲液洗涤3～5次，去除残留溶液；向每个已包被抗体的离心管中加人检测样品上清液100μL,25℃下放置2h～3h或4℃冰箱中放置过夜，PBST缓冲液洗涤3～5次，双蒸水洗涤1次，去除残留溶液，加人下游引物进行反转录合成cDNA后,PCR扩增。健康的植物组织作阴性对照，感染ORSV的植物组织作阳性对照，用超纯水作空白对照。具体操作见附录 D。6结果判定酶联检测阳性，使用ORSV特异性引物进行 RT-PCR或 IC-RT-PCR 检测，扩增出目的条带，判定样品是携带ORSV,否则不携带。7样品保存、结果记录与资料保存7.1样品保存经检测确定携带ORSV的样品应在合适条件下保存,病叶冻干保存在-20℃或者一80℃冰箱中，做好标记和登记工作。7.2结果记录与资料保存完整的实验记录包括：样品的来源、种类、检测时间、地点、方法和结果等，并要有经手人和检测人员的签字。酶联测定应有酶联板反应原始数据,RT-PCR检测应有扩增结果图片。2 SN/T 4077—2014附录A（资料性附录）齿兰环斑病毒相关资料A.1　寄主寄主：卡特兰（Cattleya sp.）、五唇兰（Doritis pulcherrima）、石斛兰（Dendrobium sp.）、万代兰(Vanda sp.）、蝴蝶兰(Phalaenopsis sp.)、建兰(Cymbidium ensifolittm）、墨兰(Cymbidium sinense）、大花蕙兰(Cymbidium sp.）、毛兰(Eria hainanensis)、文心兰(Oncidium sp.)等。A.2 病害症状蝴蝶兰（Phalaenopsis sp.）：蝶兰上的症状有两种类型