SN_T 4103-2015猪及其加工产品中转基因成分定性PCR检测方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 4103—2015猪及其加工产品中转基因成分定性PCR 检测方法Method of polymerase chain reaction for detecting genetically modified pigs andtheir derived products2015-09-01实施2015-02-09 发布中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 4103—2015前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中国农业科学院北京畜牧兽医研究所、中华人民共和国山东出入境检验检疫局本标准主要起草人：林祥梅、王勤、王娜、刘建、朱振营、李奎、潘登科、孙敏、付伟、仇松寅、李晓琳。 SN/T 4103--2015猪及其加工产品中转基因成分定性PCR检测方法1 范围本标准规定了转基因猪及其加工产品中转基因成分定性PCR检测方法。本标准适用于转-3脂肪酸去饱和酶、转植酸酶和敲除肌肉生长抑制素基因猪及其加工产品中转基因成分的定性检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T21101动物源性饲料中猪源性成分定性检测方法PCR方法3术语、定义和缩略语下列缩略语、术语和定义适用于本文件。3.1术语和定义3.1.1转基因transgene将本物种不具有的、来源于其他物种的功能DNA序列，通过各种导人手段，使其在该物种中进行表达，以便使该物种获得新的品种特征。3.2缩略语β2M:β2 微球蛋白（β2-microglobulin）。MSTN:肌肉生长抑制素（myostatin）。Sfat-l:w-3 脂肪酸去饱和酶(omega-3 fatty acid desaturase)。APPA:植酸酶（phytase）。mtDNA:猪线粒体 DNA(mitochondrial DNA)。TE:Tris·Cl、EDTA缓冲液。Tris:三（羟甲基)氨基甲烷(tris(hydroxymethyl)aminomethane）。4　试剂4.1PCR 用引物内参照基因（猪线粒体基因)引物设计参照GB/T21101，内参照基因（猪β2M基因）、外源基因引物1 SN/T 4103--2015设计见表1。将合成的引物加入无离子水配成100 pmol/μL贮存，配成直接用于PCR反应的10 pmol/μL的工作液。表 1检测转基因动物内外基因所需的引物序列被检测基因基因来源引物序列备注扩增片段长度/bp5GCCTAAATCTCCCCTCAATGGTA3内源猪mtDNA212内对照5’ ATGAAAGAGGCAAATAGATTTTCG3′5CCGAAGGTTCAGGTTTACTC3猪β2M内源n217内对照5′ACTGATCCACAGCGTTAGG3′5GAGATCAGCAGCCTCTGTTCC3MSTN基因敲除MSTN外源6195’AGCCTATTGAATTAGCACCATTGG3′猪检测5GATGTGAAGAGCGAAATGC3转植酸酶基因APPA外源2655′ ACACCTACTCAGACAATGC3猪检测转 w-3 脂肪酸5′GGCTTCTGGCGTGTGACC3Sfat-1外源171去饱和酶基因5GTGGCGGATAACCCTTCTGAG3检测4.2其他试剂TuqDNA聚合酶，琼脂糖（电泳纯），三氯甲烷（氯仿），异丙醇，异戊醇，70%乙醇,DIL2000Marker（100 bp～2000 bp）TE缓冲液，50倍 TAE电泳浓缩缓冲液，动物组织裂解缓冲液，蛋白酶K，醋酸钠（NaAc）。试剂配置见附录 A。5仪器5.1 PCR 仪。5.2凝胶成像系统。5.3核酸蛋白分析仪。5.4高速冷冻离心机，台式小型离心机，Mini个人离心机。5.5　电泳仪。6检测方法6.1样品DNA的提取与纯化6.1.1取新鲜或冰冻动物组织块0.1g(0.5cm²）,尽量剪碎。液氮研磨后转人1.5mL离心管中,加人1mL的组织裂解缓冲液,加人蛋白酶K(20 mg/mL)和胰RNA酶(20 mg/mlL)各5μL，混匀。在65℃恒温水浴锅中水浴30min，也可转人37℃水浴12 h～24h，间歇振荡离心管数次至充分消化。在台式离心机上以12 000 r/min离心5 min,取上清液转人另一离心管中。6.1.2加等量的酚：氯仿：异戊醇（25：24：1)至上清液中，振荡混匀，12000r/min,离心5min。6.1.3取上层溶液至另管，加人等体积的氯仿：异戊醇