SN_T 0762-2011猪瘟病毒荧光RT-PCR检测方法.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 0762—2011猪瘟病毒荧光RT-PCR检测方法Protocol of real-time RT-PCR for detection of classical swine fever virus2011-05-20 发布2011-12-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准猪瘟病毒荧光 RT-PCR 检测方法SN/T 0762--2011*中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街16号邮政编码：100045网址 www. spc. net. cn电话：6852394668517548中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷*开本880×12301/16印张 0.75 字数 17 千字2011年11月第一版反2011年11月第一次印刷印数1—1600* 书号：155066·2-22593 SN/T 0762—2011前言本标准按照GB/T 1.1一2009 给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国上海出人境检验检疫局、上海市复星医学科技发展有限公司。本标准主要起草人：李春阳、刘俊平、熊炜、单松华、黄忠荣、夏懿、胡永强、李树清、王巧全。1 SN/T 0762—2011猪瘟病毒荧光 RT-PCR 检测方法1范围本标准规定了猪瘟病毒荧光RT-PCR检测的操作方法。本标准适用于猪及其产品中猪瘟病毒的检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用子本文件。GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方医3缩略语下列缩略语适用于本文件。荧光RT-PCR:荧光反转录-聚酶链式反应Ct值：每个反应管内的荧光信号量送到设定的阈值时所经历的循环数RNA:核糖核酸DEPC:焦碳酸乙二酯Taq酶:Taq DNA 聚合酶4原理猪瘟病毒是有囊膜的正链 RNA病毒。根据猪瘟病毒不厨分离株甚因的保守序列,设计一对特异性引物和一条特异性的荧光双标记探针。探针与病毒基因的保守序列结合，其结合部位位于引物扩增区域内。探针的5’端标记FAM荧光素；它发出的荧光能够被检测仪器接收，称为报告荧光基团（用R表示），3端标记TAMRA荧光素，在近距离肉能吸收5端报告荧光基团发出的荧光信号，称为淬灭荧光基团（用Q表示）。PCR反应进人退灭阶段时，引物和探针同时与目的基因片段结合，此时探针上R基团发出的荧光信号被Q基团所吸收，仪器检测不到荧光信号;PCR反应进行到延伸阶段时，Taq酶发挥其5→3外切核酸酶的功能将探针酶切水解，与此同时标记在探针上的R基团游离出来,R所发出的荧光不再为Q所吸收而被检测仪所接收。随着 PCR反应的进行,PCR产物与荧光信号的增长呈对应关系。5设备、材料和试剂5.1设备、材料5.1.1荧光 PCR检测仪。5.1.2　高速台式冷冻离心机（离心速度12000g以上）。5.1.3普通台式离心机（离心速度3000g）。 SN/T 0762--20115.1.4 匀浆器。5.1.5冰箱(2℃～8℃，-20℃,-70℃三种)。5.1.6 微量可调移液器(0 μL～2 μL,1 μL～10 μL,10 μL～100 μL,20 μL～200 μL,100 μL~1000μL)及配套带滤芯无RNA酶的吸头。5.1.7 水浴锅(56℃,70 ℃)。5.1.8高压锅。5.1.9 无RNA酶的(离心)管(1.5 mL,0.2 mL)。5.2 试剂除特别说明以外，本标准所用试剂均为分析纯，所有试剂均用无 RNA 酶污染的容器（用 DEPC水处理后高压灭菌)分装。试验用水应符合GB/T 6682要求。5.2.1 异丙醇。5.2.2 Taq DNA 酶。5.2.3 dNTP:含 dATP、dUTP、dCTPdGTP 各 10 mmol/L。5.2.4逆转录酶。5.2.575%乙醇：用新开启的无水乙醇和DEPC水配制，一20℃预冷。5.2.6RNA核酸提取试剂盒1：组成、功能及使用注意事项参见附录 A。5.2.7猪瘟病毒荧光 RT-PCR检测试剂盒²：组成、功能及使用注意事项参见附录 B。6样品的采集与前处理6.1　总则采样过程中样本不得交叉污染，采样及样品前处理过程中应戴一次性手套。6.2采样工具及其要求6.2.1 剪刀、镊子、滴管、离心管、匀浆器。6.2.2所有上述采样工具应经121℃±2℃，15min高压灭菌并烘干或经160℃干烤2h以上。6.3样品采集和处理6.3.1肌肉或组织脏器取待检样品 2.0g置于匀浆器中,加人10mLPBS匀浆，然后将组织悬液转人离心管中3000g离心10 min取上清液转人另一无菌离心管中，