NY 553-2002禽支原体病诊断技术.pdf

ICS 11. 220B 41NY中华人民共和国农业行业标准NY/T 553—2002禽支原体病诊断技术Diagnostic techniques for avian mycoplasmosis(mycoplasma gallisepticum)2002-08-27 发布2002-12-01实施中华人民共和国农业部发布 NY/T 553—2002前言禽支原体病(avian mycoplasmosis)又称鸡败血支原体（mycoplasm gallisepticum，简称MG），常引起鸡的慢性呼吸道疾病。MG也可感染火鸡，引起传染性窦炎。世界动物卫生组织[world Organizationfor Animal Health(英),Office International des Epizooties(法),OIE]将本病例 B类动物疫病,我国将其列为二类疫病。本标准规定的方法与OIE《诊断试验与疫苗标准手册》推荐相应方法一致。本标准的附录 A为规范性附录。本标准由农业部畜牧兽医局提出。本标准由全国动物检疫标准化技术委员会归口。本标准起草单位：农业部动物检疫所。本标准起草人：郭福生、尹燕博、蒋正军、孙淑芳、陆明哲、龚振华。 NY/T 553—2002禽支原体病诊断技术1范围本标准规定了禽支原体(MG)分离鉴定和快速血清凝集试验(RSA)的技术要求。本标准适用于鸡和火鸡及其产品MG的检测。2 禽支原体的分离和监定2.1材料准备2.1.1培养基制备见附录 A(规范性附录)。2.1.2兔抗MG阳性血清和抗兔荧光抗体结合物。2.2分离2.2.1采样活禽从鼻腔、食管、气管、泄殖腔和交合器中取样。死禽从鼻腔、眶下窦、气管或气襄采样，也可吸取眶下窦和关节渗出物或结膜囊内冲洗物。对于鸡胚从卵黄囊内表面、口咽和气囊采样。2.2.2样品的处理采样后应尽快培养。如须运输，小块组织置于支原体培养基中，拭子在培养基中用力搅拌数次，将培养基运回实验室尽快培养。2.2.3接种将样品0.2mL接种于1.8mL支原体液体培养基中，依次10倍稀释至10-3,密封，37℃培养。同时将样品接种于支原体固体培养基中，置于含5%～10%二氧化碳(CO2)培养箱中培养。2.2.3.1每天检查液体培养基酸碱度，一旦发现 pH 值变化，立即接种于固体培养基中培养。若培养基酸碱度没有变化,每隔3 d～5d盲传一代,共传3代,培养 10 d后接种于固体培养基上培养。2.2.3.2固体培养基上若有菌落生长，用低倍显微镜观察菌落，可见中央突起呈荷包蛋样（有时不典型),需进一步作血清学鉴定。2.3 鉴定2.3.1用间接荧光抗体试验(IFA)鉴定 MG。取1.0 cm～1.5 cm 的琼脂块，菌落面朝上置于载玻片上，第一块载玻片上放一块待检分离物、一块已知MG菌落（S。或R株）、一块已知其他支原体菌落，第二块载玻片上放一块待检分离物。2.3.2第一块载玻片上每块琼脂块上加-滴适当稀释的兔抗MG血清，第二块载玻片上琼脂块上加一滴正常兔血清。2.3.3琼脂块在湿盒中室温条件下反应30 min后，分别放到含有磷酸盐缓冲液(PBS)(pH7.2)的不同器血中，冲洗10 min,共冲洗2次。2.3.4将琼脂块放回原玻片，吸水纸吸取过多的水分，每块琼脂加上稀释好的抗兔荧光抗体结合物，反应、洗涤同前，最后将琼脂块放回玻片，吸干多余水分后于人射式荧光显微镜下检查结果。2. 4结果判定菌落呈现亮绿色荧光时为阳性反应，若仅有暗淡的菌落轮廓，与背景荧光颜色差别不大为阴性。其他已知支原体菌落、第二块载玻片分离物为阴性；第一块载玻片分离物、与已知MG菌落为阳性结果时，证明分离物为鸡毒支原体。1 NY/T 553—20023快速血清凝集试验(RSA)3.1从鸡群采集的血清样品，如不能立即进行试验，应4℃保存,不能冻结。3.2试验用染色抗原、阳性及阴性对照血清。3.3操作方法：室温中加一滴(20μL)血清于白瓷板或玻板上，再加等量染色抗原，用棉签或火柴棒将其混合，轻轻摇动玻板使之混合均匀。试验设阳性血清及阴性血清对照。3.4结果判定：室温条件下，56℃30 min 处理后的鸡血清2 min 内，火鸡血清 3min 内判定结果。规定时间内，发生完全凝集的，判为阳性。如仅在液滴边缘部分出现凝集，或超过2min（火鸡3min)在边缘出现凝集，判为可疑。超过规定时间无凝集者,判为阴性。 NY/T 553—2002附录A(规范性附录)支原体培养基的制备A.1支原体肉汤培养基A.1.1新鲜酵母浸出液的制备：称取 250g具有活性的鲜酵母,悬浮于1 000 mL蒸馏水中,加热至沸点，冷却。3000r/min离心20min，倾出上清液，用0.1mol/L氢氧化钠(NaOH)调pH至7.8～8.0。过滤除菌，置 4℃保存备用。A.1.2