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厌氧真菌木聚糖酶粗酶的提取与性质研究 木聚糖酶（ec3.2.1.8）可以特异性地分解木聚糖。其产物主要是木槿糖、木糖和阿拉伯糖。由于其抗粮因素（木聚糖）的降低，近年来，作为主要酶的酶制剂，该酶可以广泛应用于食品行业，并取得了良好的效果。木聚糖酶可由多种微生物产生,目前我国多集中于黑曲霉、木霉等霉菌木聚糖酶的研究。研究表明,厌氧真菌能产生一系列植物细胞壁降解酶,如纤维素酶、半纤维素酶(包括木聚糖酶)、酯酶和植酸酶等,在植物纤维降解中起重要作用。目前来自于好氧霉菌的酶主要只能作用于经处理过的非晶体状底物,而当以滤纸片和麦秸粉作底物时,其降解能力远不如厌氧真菌产生的酶。本实验以一株分离自黑白花种公牛粪样的高产木聚糖酶的厌氧真菌菌株为材料,对其木聚糖酶粗酶的提取方法及其性质进行了研究。 1 材料和方法 1.1 蘑菇 试验菌株来自南京农业大学消化道微生物实验室筛选的木聚糖酶高产菌株,编号为A4。 1.2 培养基po 种子培养基每1L含NaHCO35 g,葡萄糖1 g,酵母膏1 g,蛋白胨1 g,L-半胱氨酸盐酸盐1.5 g,0.1%刃天青1 mL,无细胞瘤胃液170 mL,缓冲液A(每100 mL含KH2PO40.3 g,NaCl 0.6 g,(NH4)2SO40.3 g,CaCl2·2H2O 0.04 g,MgSO4·7H2O 0.06 g)、B(每100 mL含K2HPO4·3H2O 0.4g)各165 mL。产酶培养基除不含葡萄糖外,其他成分与种子培养基相同。种子培养基和产酶培养基的底物均为稻草片段(小于3 mm),其干物质含量为8 g·L-1。所有培养基均在厌氧条件下制备和分装,每瓶90 mL,加盖塑胶塞,并以铝盖密封后,121 ℃灭菌15 min。进行发酵实验时,根据Zhu等的方法,每瓶产酶培养基接种10 mL已生长3 d的菌种混合悬浮液,39 ℃静止培养96 h。 1.3 配制酸调节ph 可溶性木聚糖的制备:参照Ghangas等的方法,将燕麦木聚糖(Sigma)制成可溶性木聚糖溶液,并用1 mol·L-1的乙酸调节pH至7,所得溶液于-20 ℃保存备用。 木聚糖酶活力的测定:参照Lowe等的测定方法,以含有酶液但不含木聚糖底物的反应体系作比色对照。以每分钟每毫升酶液释放1 μmol木糖的酶量为1个酶活力单位(U·mL-1)。每分钟每克蛋白释放1 μmol木糖的酶量定义为1个酶比活力单位(U·g-1)。 蛋白含量的测定:参照文献中的Bradford方法,以牛血清清蛋白为标准。 1.4 下固体木聚糖酶活力的测定 发酵结束后,发酵液经过滤,4 000g离心15 min,收集上清液。分别取50 mL上清液,在20 ℃下加入固体(NH4)2SO4使其饱和度分别为30%、40%、50%、60%、70%和75%,充分混合均匀,4 ℃下放置12 h,4 000g离心15 min,然后分别测定其上清液及沉淀物中木聚糖酶的酶活力。以上清液及沉淀物中木聚糖酶酶活力的相对大小确定硫酸铵的最佳盐析用量。 1.5 粗酶粉的制备 按最佳盐析用量添加(NH4)2SO4于发酵上清液中,经离心得到粗酶沉淀,然后将其于45 ℃干燥,制成粗酶粉。取适量干燥粗酶粉溶于蒸馏水中,在0.1 mol·L-1柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH 6.0)中透析除盐,将得到的粗酶透析液用于酶学性质研究。 1.6 对粗酶性质的测量 1.6.1 反应温度对酶促过程的影响 将所得粗酶液用0.1 mol·L-1柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH 6.0)适当稀释后,分别在不同温度(20～70 ℃)下反应30 min,测定其酶活力,以酶活力最高时的温度为酶促反应最适温度。 1.6.2 酶促反应最适ph的测定 将粗酶液分别用不同pH值(pH 2.2～8.0)的0.1 mol·L-1柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液适当稀释后,在各自对应的pH下测定其酶活力,以酶活力最高时的pH为酶促反应最适pH。 1.6.3 不同温度对残余酶活力的影响 将粗酶液用0.1 mol·L-1柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH 6.0)适当稀释后,分别在37、50、60和80 ℃下保温,每隔10 min取样,快速冷却至室温后,按常规方法测定残存酶活力。 1.6.4 酶活测定 将粗酶液分别用不同pH值(pH 2.2～8.0)的0.1 mol·L-1柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液,或0.05 mol·L-1磷酸氢二钠-氢氧化钠缓冲液(pH 9.0～11.0)适当稀释,4 ℃放置24 h后,测定其酶活力。 1.6.5 初始酶活力测定 将粗酶液分别用pH值为3.0、5.0、7.0、8.0的0.1 mol·L-1柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液适当稀释,37 ℃下保温,隔适当时间取样,快速冷却至室温后,按常规方法测定残存酶活力,以初始酶活力为对照。 1.7