SN 1559.3-2005非洲猪瘟病毒红血球吸附试验操作规程.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1559.3-2005非洲猪瘟病毒红血球吸附试验操作规程Protocol of haemadsorption test for African swine fever virus2005-02-17发布2005-07-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局数码防伪 SN/T 1559.3—2005前言本标准参照了国际动物卫生组织(OIE)公布的《诊断试验和疫苗标准手册》(2004 年版)中关于非洲猪瘟诊断的红血球吸附试验方法。本标准的附录 A为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国广东出人境检验检疫局负责起草。本标准的主要起草人：游洪、许如苏、刘中勇、王彭军。本标准系首次发布的出人境检验检疫行业标准。 SN/T 1559.3--2005非洲猪瘟病毒红血球吸附试验操作规程1范围本标准规定了红血球吸附试验检测非洲猪瘟病毒的方法。本标准适用于检测组织或外周血中的非洲猪瘟病毒。2仪器设备2.1 组织研磨器或捣碎器。2.2 离心机。2.3二氧化碳培养箱。2.41恒温培养箱或水浴箱。2.5显微镜、倒置显微镜。2.6 leigton 管(160 mmX16 mm)。3试验材料3.10.9%氯化钠：配制方法参见附录A。3.20.01 mol/L pH7.4 PBS(磷酸盐缓冲液):配制方法参见附录 A。3.3青霉素、链霉素、庆大霉素和制霉菌素。使用前宜用上述PBS 分别配成10 000 IU/mL、10 mg/mL.500 IU/mL 和 500 IU/mL 的溶液。3.4肝素：使用前用0.9%氯化钠配成1 000 IU/mL3.5细胞基础培养液（如MEM等）：配制方法参见附录A。3.6 1%猪红血球:配制方法参见附录 A。3.7非洲猪瘟标准毒株。3.8被检材料：包括肝素抗凝血和脾脏、扁桃体、肾脏、淋巴结等组织。被检材料应置于尽可能的低温，但不冻结的容器内保存、运送。4操作方法4.1原代白细胞血球吸附试验4.1.1制备组织悬液用组织研磨器或捣碎器将被检组织磨碎，加人0.01mol/LpH7.4PBS和抗菌素，配制成20%的组织悬液（每毫升组织悬液的抗菌素含量为：青霉素 1 000 IU,链霉素 1 mg，庆大霉素 50 IU,制霉菌素50IU),备用。4.1.2 制备白细胞采取健康猪血，用玻璃珠脱纤或用肝素抗凝（每毫升猪血含肝素 100 IU)，700 g离心30 min，吸出血清或血浆备用。另外吸取白细胞，并用细胞基础培养液洗涤3次，备用。4.1.3配制细胞培养液将上述血清或血浆加人细胞基础培养液内配制成细胞培养液，血清或血浆的终浓度为 10%～30%，同时加入抗菌素。4. 1. 4 培养白细胞将白细胞悬浮于细胞培养液中，使细胞含量为10°/mL分装于160mm×16 mm 的leigton管中，Y SN/T 1559.3—2005每管1.5mL,将试管与水平面呈5°～10°倾斜放置，置于5%二氧化碳环境中，37℃培养2d～4d;或将白细胞分装于细胞培养板，每孔0.1mL,置于5%二氧化碳环境中,37℃培养 2 d～4 d。4.1.5接种每份组织悬液接种3管或4孔白细胞培养物，每管接种0.2mL或每孔接种25μL。用工作浓度的非洲猪瘟标准毒株接种 1管或1孔白细胞培养物，作阳性对照。另留 1管或 1孔白细胞培养物不接种病毒,作阴性对照。4.1.6加红血球37℃培养3d后，每管加人0.2mL或每孔加人25μL1%猪红血球，继续培养于37℃。4.1.7镜检每天用显微镜或倒置显微镜检查细胞病变和红血球吸附情况,连续检查7 d～10 d。4.1.8结果判定将培养物轻轻摇动后置于低倍镜下(10×)观察。阳性对照的白细胞表面有大量猪红血球附着，形成玫瑰花状或桑套体状；而阴性对照的白细胞无红血球附着，则对照成立，可进行结果判定。以第10天的检查结果为终判结果。1管或1孔以上白细胞表面吸附有大量猪红血球的被检材料，判为阳性;否则判为阴性。如为阴性，宜将培养物的上清液再传代或用直接免疫荧光试验检测白细胞沉淀物。4.2外周白细胞“自动玫瑰花环”血球吸附试验4.2.1制备抗凝血用装有2mL0.9%氯化钠，含2000 IU肝素的注射器取18mL被检猪全血，混均后转移到试管或小瓶中。4. 2. 2细胞沉淀将试管或小瓶垂直放人37℃培养箱或水浴箱中，静置，使细胞沉淀。4.2.3镜检6 h～~8 h 后,每隔 2 h～3 h取出少量富含白细胞并带有~些红血球的上清液,滴到载玻片上，用显微镜检查红血球吸附情况。4.2.4结果判定白细胞表面出现大量红血球附着的判为阳性;否则判为阴性。注：外周白细胞”自动玫瑰花环”血球吸附试验从可疑感染猪采集抗凝血，直接检测白细胞血