SN_T 3755-2013豌豆脚腐病菌检疫鉴定方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T3755—2013豌豆脚腐病菌检疫鉴定方法Detection and identification of Phoma pinodella(L.K.Jones)Morgan-Jones K.B.Burch2013-11-06发布2014-06-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局利涂层我真伤 SN/T3755—2013前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任，本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院本标准主要起草人：张秋娥、杜洪忠、严进、吴品娜、段胜男。1 SN/T 3755—2013豌豆脚腐病菌检疫鉴定方法范围T本标准规定了植物检疫中豌豆脚腐病菌[Phoma pinodella（L.K.Jones）Morgan-Jones K.B.Burch]的检疫鉴定方法。本标准适用于对来自疫区的豌豆脚腐病菌所有寄主植物的根、茎，吐及种子中的豌豆脚腐病菌的检疫鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样3豌豆脚腐病菌基本信息学名：Phoma pinodella异名:Ascochyta pinodella; Phonu trifolii;var. pinodella ; Peyronellaeama medicaginispinodella ; Ascochyta sojicola ; Phonta sojicola ;Asfochyta sojicola ; Phoma trifolii分类地位：真菌界（Fungi），子囊菌门（Ascomycota），子囊菌纲（Ascomycetes），间座壳目（Dia-porthales），黑腐皮壳菌科（Valsaceae）传播途径：以菌丝、分生孢子或分生孢子器随种子或植株残体的调运进行远距离传播。豌豆脚腐病菌的其他信息参见附录A。4方法原理豌豆脚腐病菌的寄主症状、菌落特征及形态学特征是该病菌检疫鉴定的依据。5培养基、试剂及主要仪器设备5.1培养基及试剂麦芽膏琼脂培养基MA（麦芽膏25g，琼脂17g～20g，水1000mL）、燕麦片琼脂培养基OA（燕麦粉30g，琼脂17g～20g，水1000mL）、1%次氯酸钠、无菌水、75%乙醇。5.2仪器与设备立体显微镜、生物显微镜（具油镜和测微尺）、电子分析天平（感量0.001g）、普通天平（感量0.1g）、超净工作台、生物培养箱、高压灭菌锅。1 SN/T 3755—20136检疫与鉴定方法6.1症状检查豌豆脚腐病菌侵染其寄主植株的症状参见A.3。6.2分离培养选取有症状的叶、茎或根，取病健交界处用75%艺醇表面消毒30$，无菌水冲洗3次，放于MA培养基上，在（20士2）℃下，12h黑暗/光照交替培养。种子：挑取变色或皱缩的种子先进行速冻，然后用1%次氯酸钠表面消囊1min，无菌水冲洗3次。用无菌吸水纸吸干种子表面的水分。将种子均匀摆放至MA培养基上，在（20士2）℃下，12h黑暗/光照交替培养。分离的菌株采用单孢分离的方法进行纯化。6.3形态学观察纯化后的菌株转到MA和OA培养基上培养，观察菌落形态、颜色，分生孢子器生成方式及形态、分生孢子形态等特征；测量菌丝生长速率及分生孢子器、分生孢子大小。6.4致病性测定选取苗龄为3周的豌豆苗，采用喷雾法接种浓度为1×10°个/mL的孢子悬浮液40mL（含1μl.吐温80）。以无菌水加吐温80为对照。保湿24h，然后转移到20℃，相对湿度为80%，12h光照的培养室内培养。每天观察症状并记录。6.5鉴定特征6.5.1菌落特征在MA或OA培养基上，病菌菌丝灰褐色至黑色，在培养基中成扇形扩展如毡状，菌落外缘规则。在OA培养基上，培养7d后菌落直径为50mm～65mm；MA培养基上，培养7d后的菌落直径为50mm~55mm，有大量具典型扇状树枝形晶体（见B.1）。6.5.2形态学特征分生孢子器球形或不规则，有孔口，直径96μm～320um。分生孢子透明，卵形或椭圆形，多数无隔膜，偶尔有一个隔膜，大小为[4μm～7（～7.5)μmJ×（2um～3.5μm）。有时随培养时间的延长孢子变黄褐色。厚垣孢子单个或成串产生在菌丝顶端或中间，黑褐色，球形至不规则形，多数光滑，（8um～20μm）×（8μm~15μm)（见B.2和B.3）。6.5.3致病性测定致病性测定结果符合豌豆脚腐病症状特征（见B.4）且重新分离获得的病原菌形态学特征与6.5.1和6.5.2描述吻合。7结果