NYT 1187-2006鸡传染性贫血病毒聚合酶链反应试验方法.pdf

ICS 11.220B 41NY中华人民共和国农业行业标准NY/T 1187—2006鸡传染性贫血病毒聚合酶链反应试验方法Polymerase chain reaction for chicken infectious anemia virus2006-10-01实施2006-07-10发布中华人民共和国农业部发布 NY/T 1187--2006前言鸡传染性贫血（Chicken Infectious Anemia）是由鸡传染性贫血病毒（Chicken Infectious AnemiaVirus)引起的一种传染病,主要损害鸡的造血和淋巴器官,引起雏鸡再生障碍性贫血和全身淋巴组织萎缩,导致免疫功能抑制，已成为危害养鸡业的重要疫病之一。本标准附录 A为规范性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会归口。本标准主要起草人：田克恭、王宏伟、孙明、王传彬、陈西钊。I NY/T 1187---2006鸡传染性贫血病毒聚合酶链反应试验方法1范围本标准规定了鸡传染性贫血病毒(CAV)聚合酶链反应(PCR)的技术要求。本标准适用于鸡面清和组织中的鸡传染性贫血病毒检测。2 试剂2.1消化液(见附录A.1)2.2 2%蛋白酶 K溶液2.3酚/氯仿/异戊醇混合液（见附录A.2)2.4 2.5 mmol/LdNTP2.58mmol/L上下游引物混合液(引物序列见附录A.3)2.6 0.5 U/μL TaqDNA 聚合酶2.710×PCR缓冲液2.81%溴化乙锭(EB)溶液2.9TAE电泳缓冲液2.101%琼脂糖凝胶2.11上样缓冲液(见附录A.4)2.12其他试剂：异丙醇（分析纯）、100bpMarker、75%乙醇溶液、15mmoL/L氯化镁溶液、灭菌双蒸水。3实验室条件3.1实验室必须为生物安全Ⅱ级(BSL-2级)以上实验室。3.2 实验室分区:PCR试验区域分 PCR反应液配制区一配液区、模板提取区、扩增区、电泳区;流程顺序为配液区→模板提取区-→扩增区→电泳区。严禁器材和试剂倒流。3.3实验室应配备的仪器及耗材3.3.1仪器：分析天平、高速离心机、真空干燥器、PCR扩增仪、电泳仪、电泳槽、紫外凝胶成像仪（或紫外分析仪）、液氮罐或一70℃冰箱、微波炉、组织研磨器、一20C冰箱、水浴锅、可调移液器（最大量程为2 μL20 μL,200 μL、1 000 μL)。3.3.2耗材:眼科剪、眼科镊、称量纸、10mL一次性注射器、1.5mL灭菌离心管、0.2mL薄壁PCR管、琼脂糖、500mL量筒、500mL锥形瓶、吸头（10μL、200μL、1000μL）、灭菌双蒸水。4　操作程序4.1样品的采集与处理4.1.1 样品的采集:濒死鸡、扑杀鸡取肝脏;待检活鸡,用注射器取血 2 mL～4 mL,立即送往实验室。4.1.2样品的处理：每份样品分别处理。组织样品处理:取待检病料约0.2g置研磨器中剪碎并研磨,加人2 mL消化液继续研磨。取已研磨好的待检病料上清200μL,置1.5mL灭菌离心管中,再加人400μL.消化液和10μL蛋白酶K溶1 NY/T 1187—2006液,混匀后,置 55℃水浴中4 h～16 h。血清样品处理；待血液凝固后取血清放于离心管中,4℃8000g离心5min,取上清200μL,置1.5mL灭菌离心管中,加人 400μL消化液和10μL蛋白酶K溶液,混匀后,置 55℃水浴中 4 h～16 h。阳性对照处理:取鸡传染性贫血病毒细胞培养液200uL,置1.5mL灭菌离心管中,加入 400μL消化液和 10μL蛋白酶K溶液,混匀后,置 55℃水浴中 4 h～16 h。阴性对照处理：取SPF鸡血清200μL,置1.5mL灭菌离心管中,加人400μL消化液10μL蛋白酶K溶液,混匀后,置 55C水浴中4 h～16 h。4.2DNA模板的提取4.2.1取出已处理的待检样品及阴性、阳性对照,每管加人600μL酚/氯仿/异戊醇混合液，用力颠倒10次混,13 000g离心10 min。4.2.2取上清置1.5mL灭菌离心管中,加人等体积异丙醇,混匀,置液氮中3min或一70℃冰箱中30min。取出样品管，室温融化，一4℃20000g离心15mino4.2.3弃上清，沿离心管开口方向管壁缓缓滴入－20℃预冷的75%乙醇液1mL,轻轻旋转洗一次后倒掉,将离心管倒扣于吸水纸上1min,真空抽干15min。4.2.4取出样品管，用50μL灭菌双蒸水溶解沉淀，作为模板备用。4.3PCR扩增:每管取灭菌双蒸水 8 μL、2.5 mmol/L dNTP、8 mmol/L CAV引物、15 mmol/L 氯化镁10×PCR缓冲液、0.5U/μL Taq DNA聚合酶各2 μL,DNA模板2 μL。混匀，作好标记,加人矿物油20μL