SN 1449-2004马流行性淋巴管炎检疫方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1449—2004马流行性淋巴管炎检疫方法Quarantine method for epizootic Iymphangitis2004-06-01发布2004-12-01实施中华人民共和国发布$RST“数码防伪】国家质量监督检验检疫总局 SN/T 1449—2004前言本标准的附录 A 和附录 B均为规范性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国山东出人境检验检疫局。本标准主要起草人：卢晓中、王作佳、徐彪。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。 SN/T 1449—2004马流行性淋巴管炎检疫方法1 范围本标准规定了马流行性淋巴管炎的病原分离鉴定、酶联免疫吸附试验和皮内变态反应的检疫方法。本标准适用于进出境马流行性淋巴管炎的检疫。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T4789.28食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法3病原分离鉴定3.1器具棉拭子、平血、外科剪、镊子、恒温箱、高压灭菌器、铂金耳、酒精灯、显微镜、超净工作台等。3. 2 培养基及试剂3.2.1动物脏器培养基：制备方法见附录A。3.2.2灭菌生理盐水、革兰氏染液、动物脏器培养基、4%葡葡糖肉汤、糖发酵管、明胶、蛋白陈水、靛基质试剂、硫酸亚铁琼脂、缓冲葡萄糖蛋白陈水、生牛乳等。3.2.3实验用水见GB/T6682。3.3采样采集被检动物软化的未破溃的皮肤结节、化脓灶或病变淋巴结，消毒处理后无菌操作采取脓汁于无菌空试管或无菌平血内，或直接无菌采取病变组织块于无菌平皿中。脓汁用灭菌生理盐水适当稀释后作为被检材料，干瘤的痴皮须加适量的10%～30%氢氧化钾(氢氧化钠)液或生理盐水，使其充分溶解后检查。3.4操作方法3.4.1显微镜检查无染色压片标本镜检.1用铂耳挑取处理过的病料于洁净的载玻片上，覆盖洁净的盖玻片。.2在弱光下，先以显微镜(400倍～500倍)检查，然后再用油镜检查。脓汁中的流行性淋巴管炎马伪皮疽组织胞浆菌呈双层膜卵圆形或梨子形，一端或两端尖锐,大小(3 μm～4 μm)×（2 μm~～3 μm)，菌体内为半液状，并可见到一至数个能活泼运动的小颗粒。染色标本检查.1用棉拭子直接沾取被检动物化脓灶周边或病变淋巴结、病变结节组织渗出液涂抹载玻片。.2自然干燥后火焰固定。.3依照GB/T4789.28规定进行革兰氏染色。.4镜检方法同.2。 SN/T 1449-2004标本背景为淡紫色，白细胞内外可以清楚地看到流行性淋巴管炎马伪皮疽组织胞浆菌，呈淡灰色，菌体边缘呈紫色，小颗粒呈黑紫色或黑色，3.4.2分离培养取制备好的动物脏器培养基（见附录A)试管五支，无菌操作将采集的样品用接种棒勾取绿豆粒至黄豆粒大小的脓液，或切取结节(淋巴结组织)内壁小组织块，放置培养基斜面下三分之一处。将接种好的试管置28℃恒温培养，若培养超过10d，向试管内加灭菌生理盐水，加入量以不超过培养物为宜。经过4d～15d培养，在原接种部位上面出现乳白色至淡灰色小菌落，之后菌落逐渐出现突!起的皱褶，色泽也逐渐变深，菌落呈较大的不整形皱褶。伪皮疽组织胞浆菌在培养基上呈以菌丝为主的生长发育繁殖，淡黄色或褐色，形成突起不整形皱褶菌落，初湿润，后变干燥。3.4.3分离菌株鉴定显微镜检查：取典型或可疑纯培养物在载玻片上用生理盐水稀释加盖玻片后进行显微镜检1查。马伪皮疽组织胞浆菌呈粗细不等、分隔分枝的菌丝体，有些菌丝末端形如烧瓶状膨大部分，即分生孢子，有时还可见到厚膜抱子及关节孢子。4%葡萄糖肉汤培养：接种典型或可疑纯培养物于4%葡萄糖肉汤培养6d～13d,液体保持透明，液面生长呈黄褐色多皱褶的菌膜，培养时间较长时，表面呈撒粉样，液体深部有时呈现高粒大毛球样发育。生化试验：取典型或可疑纯培养物依据表1进行生化试验。所有生化试验管均在28℃恒温培养箱培养10d。表 1马伪皮疽组织胞浆菌生化特性试验糖发酵名称靛基质反应硫化氢试验明胶生乳VP 试验麦芽糖「乳糖葡萄糖「甘露醇蔗糖不发酵阴性液化凝固阴性不发酵不发酵不发酵不发酵！反应阴性L3.4.4结果判定根据、和的结果进行判定。符合前述马伪皮疽组织胞浆菌特征的判定为阳性。4酶联免疫吸附试验4.1材料4.1.1抗原、酶标抗体、阴性血清、阳性血清。4.1.2抗原包被液、封闭液、PBS洗涤液、终止液配制方法见附录B。4.1.3酶标反应板、酶标仪、加样器等。4.1.4被检血清。4.1.5实验用