SN_T 3581-2013美澳型核果褐腐病菌实时荧光PCR检测方法.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3581—2013美澳型核果褐腐病菌实时荧光PCR检测方法Detection and identification of Monilinia fructicola (Winter) Honeywith real-time fluorescence PCR2013-03-01 发布2013-09-16实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准美澳型核果褐腐病菌实时荧光 PCR检测方法SN/T 3581--2013*中国标准出版社出版北京市朝阳区和平里西街甲2号（100013)北京市西城区三里河北街16号（100045）总编室：（010址 www. spc. net. cn中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷*开本 880×12300　1/16　印张 0.5字数 10 千字2013年8月第一版2013年8月第一次印刷印数 1-1 600* 书号：155066·2-25768 SN/T 3581--2013前言本标准按照GB/T 1.1一2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布结构不承担识别这些专利的责任。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院。本标准主要起草人：程颖慧、王颖、章桂明、汪莹。1 SN/T 3581—2013美澳型核果褐腐病菌实时荧光PCR检测方法1范围本标准规定了美澳型核果褐腐病菌［Monilinia fructicola（Winter）Honey]的应用 TaqMan MGB探针进行实时荧光PCR的检测方法。本标准适用于美澳型核果褐腐病菌的寄主包括核果类水果，以及木瓜属、山楂属、枇杷属等传带美澳型核果褐腐病菌的寄主上的该病菌的分子检测。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法SN/T 1193基因检验实验室技术要求SN/T1871美澳型核果褐腐病菌检疫鉴定方法3原理3.1病菌分类地位及形态特征按照 SN/T 1871。3.2鉴定原理根据美澳型核果褐腐病菌与其近似种包括核果褐腐病菌和欧洲仁果褐腐病菌的内间隔转录区基因的不同，设计特异性的引物和探针，应用相关仪器，包括实时荧光PCR仪等对美澳型核果褐腐病菌进行实时荧光 PCR鉴定。4　主要仪器用具和试剂4.1主要仪器及用具烘箱、高压灭菌锅、天平（感量1/100，1/10000）、研钵、摇床、水浴锅、制冰机、纯水仪、旋涡振荡器、台式离心机、核酸蛋白分析仪、高速冷冻离心机、真空抽干仪、冰箱、超净工作台、实时荧光PCR仪、微量移液器(0.5 μL,2 μl,10 μL,20 μL,100 μL,200 μL,1 000 μL)、离心管(0.2 ml,1. 5 mL,2.0 mI)、Tip 头(0.1 μL ～10 μL,5 μL ～200 μL,100 μL ～1 000 μL)、试管。4.2试剂CTAB提取液、Tris 饱和酚、三氯甲烷、异戊醇、异丙醇、无水乙醇、RNA酶、液氮、实时荧光PCR反应缓冲液。1 SN/T 3581—2013注：除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。5检疫鉴定5.1病原菌的分离培养病原菌的分离培养按照 SN/T1871进行。5.2样品核酸的提取收集分离培养得到的菌丝或者直接取疑似罹病果实发病部位组织，于研钵中液氮冷冻后研磨，采用CTAB法提取病原菌总DNA。具体方法如下：a）将液氮研磨处理的菌丝或组织转至2mL离心管，加人65C预热的CTAB提取液700uL，置于水浴锅中65℃水浴30min，期间不断混勺；b）加人5μL10mg/mL RNA酶，充分混勾，在37℃放置30min；c）加人等体积的 Tris 饱和酚，充分摇匀,在 000g下离心i5 min;d）取上清液，加人1：1三氯甲烷/异戊醇（24：1)，在,16000g下离心15min；再取上清液，加人1：1三氯甲烧/异戊醇（24=-),在12000g下离心15min；e）加入等体积预冷的异丙醇,轻轻摇冕，置=20~℃尔箱静置30 min，在 16 000 g下离心f）15 min;g）弃上清液，加人70%乙醇5doμL，16 000g下离心3min，去上清液，重复2次；h）得到DNA沉淀，用冷冻于燥仪进行干燥，加人50μL_100μLTE或无菌去离子水，充分溶解后，测量DNA的纯度和浓度后置于一20℃冰箱中保存。注：也可使用试剂盒进行DNA提取，具体方法接照试剂鑫说明书操作。5.3实时荧光 PC