SN_T 3730.5-2013食品及饲料中常见畜类品种的鉴定方法　第5部分：马成分检测　实时荧光PCR法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3730.5—2013食品及饲料中常见畜类品种的鉴定方法第5部分：马成分检测实时荧光 PCR法Identification of domestic animal ingredient in food and feed--Part 5 :Detection of horse ingredient--Real-time PCR method2013-11-06 发布2014-06-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局本志情 SN/T 3730.5--2013前言SN/T3730《食品及饲料中常见畜类品种的鉴定方法》共分为以下8个部分：第1部分：貂成分检测实时荧光PCR法；第2部分：狗成分检测实时荧光 PCR法；第3部分：狐狸成分检测　实时荧光PCR法；第4部分：驴成分检测实时荧光PCR法；第5部分：马成分检测实时荧光PCR法；一第6部分:猫成分检测　实时荧光 PCR法；第7部分：水牛成分检测　实时荧光PCR法；第8部分：猪成分检测实时荧光 PCR法。本部分为SN/T3730的第5部分。本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院。本部分主要起草人：宗卉、卢体康、曹琛福、张彩虹、韩建勋、孙洁、唐金明、杨俊兴、吴亚君、花群义。 SN/T 3730.5—2013食品及饲料中常见畜类品种的鉴定方法第5部分：马成分检测实时荧光PCR法1范围SN/T3730的本部分规定了食品及饲料中马源性成分检测的实时荧光PCR方法本部分适用于食品及饲料中马源性成分的定性检测2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1real time PC实时荧光PCR在PCR反应体系中加人荧光基团，利用荧光信号的积累实时监控整个PCR扩增过程。3.2Ct 值I cycle threshold每个反应管内的荧光信号达到设定的值时所经历的循环数，4缩略语下列缩略语适用于本文件。DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonuleic acid)dNTP:脱氧核糖核苷三磷酸(deoxy-ribonucleoside triphosphate）PCR:聚合酶链式反应(polymerase chain reaction)ROX:6-羧基-X-罗丹明(6-carboxy1-X-Rhodamine)CTAB：十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrithylammonium bromide)Tris:三（羟甲基)氨基甲烷Ltris(hydroxymethyl）aminomethane]EDTA:乙二胺四乙酸(ethylene diaminetetraacetic acid)5　方法提要样品经研磨混匀后，提取DNA，以DVA为模板，采用马线粒体ATPase6基因特异性检测引物和1 SN/T 3730.5—2013探针进行实时荧光PCR扩增，根据Ct值，判断样品中是否存在马成分。6试剂和材料除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂，实验用水符合GB/T6682的要求。所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。6.1检测用引物(对)序列和探针马成分扩增引物和探针详见表1。表1试验用引物和探针名称序列(5′-3)目的基因F: 5-TGTAGCCCTAGCCGTGCGGCTAACC-3马成分5端引物马成分3端引物R:5′-TAGGATGATAAACGTAATAAGGGCTG-3马线粒体ATPase6基因马成分探针 P: 5-FAM-CGCCGGACACCTCCTAATACACCTC-ECI.IPSE-36.2 试剂6.2.1裂解液:1% CTAB;0.05 mol/L Tris-HCl(pH8.0);0.7 mol/1. NaCl;0.01 mol/L EDTA(pH8.0)。6.2.2DNA 聚合酶。6.2.32×荧光 PCR缓冲液。6.2.4硫酸镁。6.2.5dNTP混合液。6.2.6 ROX染料。6.2.7三氯甲烷。6.2.8异丙醇。6.2.975%乙醇。6.2.10双蒸水。1仪器和设备7.1离心机（最大离心力大于12000g）。7.2微量移液器(100 μL～l 000 μL,20 μL～200 μ,2 μL～20 μL,0.5 μl～10 μL)。7.3实时荧光 PCR仪。7.4恒温水浴锅。7.5天平:感量0.001g和0