二倍体野生菊甘菊种间杂交花粉活力及胚胎发育研究.docxVIP

二倍体野生菊甘菊种间杂交花粉活力及胚胎发育研究 菊花育种通常采用植物品种与菊花远离边缘的混合进行抗逆性。然而已有研究表明,在菊花远缘杂交,尤其是低染色体倍性野菊与栽培菊种间杂交中,经常遇到结实率低,甚至不能获得杂交种子的问题,致使优异基因难以导入栽培品种中以实现其抗性改良(南汝斌和孙自然,1991;戴思兰和陈俊愉,1996;唐岱,2000;李辛雷 等,2008)。引起被子植物种间杂交失败的原因一般包括:(1)父本花粉活力低或母本雌蕊发育异常;(2)父本花粉在母本柱头不能萌发或花粉管生长异常;(3)花粉管不能穿过花柱将精子带到胚囊完成双受精;(4)受精后幼胚或胚乳发育异常引起胚胎败育(van Tuyl et al.,1991;孟金陵,1997;Wilcock Neiland,2002;胡适宜,2005;Datson et al.,2006)。迄今,在菊属植物种间杂交中,不同组合杂交效果差异很大,只有一小部分组合结实率较高,而大部分组合杂交效果很不理想。虽有一些研究认为父本花粉管在母本柱头生长情况可能对杂交结实率有一定的影响,但引起远缘杂交失败或结实率低的具体因素还是不很清楚。 本研究中以二倍体野生菊甘菊为父本,以作者近年选育的栽培菊‘金陵黄玉’为母本,开展种间杂交、传粉及胚胎发育等细胞与生殖生物学研究,旨在阐明其杂交失败的原因,为今后采取有效措施将低倍性野生菊中各种优良抗性基因向栽培菊中转移,实现菊花品种抗性改良提供理论指导。 1 材料和方法 1.1 花粉萌发培养基 以栽培菊(Dendranthema grandiflorum)‘金陵黄玉’(2n=6x=54)为母本,野生菊甘菊(D.lavandulifolium)(2n=2x=18)为父本杂交,均保存在南京农业大学“中国菊花种质资源保存中心”。 于晴天10:00—14:00每隔2 h采集父本花粉,花粉萌发培养基配方为ME3+200 g·L-1PEG4000,在20 ℃条件下培养(赵宏波 等,2005)。每隔1 h在显微镜下检测花粉萌发情况,以花粉管长度大于花粉直径视为花粉萌发,随机观察10个视野进行记录,重复3次。 1.2 花粉套袋和套袋 2007年10月上旬,以生长健壮的母本植株为材料,选取发育良好的花蕾,在舌状花刚露色时去雄,用硫酸纸折成的透明纸袋进行严格套袋。去雄后3～5 d,母本柱头开始伸出并呈“Y”形,柱头表面可见大量黏液,此时为最佳授粉时间。收集已套袋的父本新鲜花粉,用毛笔将花粉轻轻地均匀地涂抹在母本柱头,立刻套袋。当花梗开始变黄枯萎时采集授粉花序,晾干后进行脱粒和统计结实率。此外,将40朵已去雄的花序在开放条件下自然授粉,统计其结实率以了解人工授粉前母本雌蕊发育状况。 1.3 荧光显微镜观察 在人工授粉后0.5、1、2、4、8、12、24和48 h时各取3个花序(20～30雌蕊/花序),用FAA进行固定,保存在4 ℃冰箱中备用。室温下将样品用去离子水清洗3次,浸于1 mol·L-1NaOH溶液中软化8 h左右,然后用离子水清洗3次,置于载玻片上,滴上数滴0.01%苯胺蓝溶液(0.1 mol·L-1K3PO4+ 18%甘油)后盖上盖玻片并轻轻挤压。大约5 min后在荧光显微镜(Zeiss Axioskop 40)下观察,记录每个雌蕊柱头上的花粉粒数,每个采样时期观察30个左右雌蕊(Teng et al.,2006)。由于样品经历了多次清洗,没有萌发仅是附着在柱头的花粉将被洗掉,因此最终在柱头上观察到的花粉可视为萌发的花粉,有的花粉看不到花粉管是因为实验技术本身所致(王钦丽 等,2002)。 1.4 faa的固定和保存 在人工授粉后6、8、10、12、15、18和22 d时各取10个花序用FAA固定,保存在4 ℃冰箱中备用。常规石蜡制片,切片厚度8～10 μm,铁矾苏木精染色,在Olympus显微镜下观察并拍照。 2 结果与分析 2.1 种子花粉活力 二倍体野生菊甘菊与栽培菊花‘金陵黄玉’杂交结实率为0,而母本在人工去雄后开放结实率却高达42.3%(共收取花序40个,得到种子406粒)。培养基上花粉活力测定结果表明,父本甘菊的花粉活力为11.2%,并且在10:00—14:00不同时间取的花粉的活力没有显著差异(图1)。从母本开放结实率来看,大部分雌蕊在授粉前发育正常,对结实率没有太大影响。 2.2 高糖花粉的萌发 观察和统计授粉后不同时间每个柱头上的萌发花粉数量(图2)和花粉萌发情况(图版Ⅰ),发现在人工授粉4 h内在母本雌蕊柱头上没有萌发的花粉;在授粉后8 h时,平均每个柱头上有7.5粒花粉萌发;到授粉后12 h时萌发的花粉量达到最多,为16.1粒,随后柱头上萌发的花粉数量急剧下降,到授粉后24和48 h时平均每柱头上萌发的花粉分别只有3.2和2.4粒,并且大部