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不同密度紫球藻细胞破碎方法的比较研究 紫球形藻是一种分布在海水、淡水和水中的独特沿海藻类。紫球藻含有丰富的生物活性物质,其中最引人注目的是其含有丰富的藻红蛋白、高不饱和脂肪酸(PUFA)和多糖等高价值的生物活性物质,如何有效地获得这些高价值的生物活性物质,已成为近几年对海洋微藻的研究热点。由于许多活性物质诸如紫球藻的藻红蛋白等,多分布于细胞内,要获得这些物质,首先要在保持其物质活性的情况下将其细胞进行有效的破碎,因此只有建立有效的破碎方法,才能获得更高产率的活性物质。 1 材料和方法 1.1 藻类藻类 紫球藻(Porphyridium cruentum),原种由中国科学院海洋研究所提供,实验用藻株系经本实验室分离纯化和筛选的纯种。 1.2 种不同密度的体外培养 紫球藻用培养基为海洋生化工程研究所提供的优化配方,培养条件:温度23℃,持续光照,连续通气,15 d后离心收集藻体细胞,蒸馏水洗涤两次后,稀释成三种不同的密度待用。 1.3 冻融温度对冻融时间的影响 将三种不同密度的紫球藻藻液分别在-10℃、-20℃、-30℃温度下进行冻融,采用每次冷冻8 h,37℃温水浴中融解5 min,共反复6次的方法。以冻融前后完整细胞个数比计算细胞破碎率。 1.4 细胞破碎实验 将3种不同密度梯度的藻体分别在4个不同的实验条件下进行细胞破碎,以破碎前后显微镜下观察完整细胞的个数计算细胞破碎率,具体实验方案如表1所示。 1.5 藻红蛋白的提取 将培养好并稀释成不同密度的紫球藻藻液离心后,用10 mmol/L(p H 6.8)的磷酸盐缓冲液悬浮,采用反复冻融法和超声波法进行细胞破碎,随后将破碎好的藻体离心,取粉色上清液,即为藻红蛋白粗提物。采用Bradford法测量其蛋白含量。 2 结果与讨论 2.1 细胞破碎率测定 将0.665 g/L,0.333 g/L和0.266 g/L三种密度的紫球藻藻液分别在-10℃,-20℃,-30℃温度下进行冻融,再在37℃温水浴中融解,利用细胞内冰粒的形成和细胞液浓度增高引起溶胀,使细胞结构破碎,其结果如表2所示。由表2中数据可以看出,在相同温度下不同密度的细胞破碎率变化不大,可以认为一定密度范围对细胞破碎率的影响不大。而在同一密度下,温度对细胞破碎率的影响很大。随着冻融温度的降低,细胞破碎率明显增大,-20℃时破碎率在50%左右,-30℃时破碎率就达到70%左右。 2.2 细胞破碎时间的影响 分别采用4种不同的实验方案,对3种不同密度的藻液进行破碎,由表3中的数据可以看出,同一实验方案下,藻液密度对细胞破碎率的影响不大,这与反复冻融法的实验结果一致。随着破碎时间的延长,细胞破碎率明显增大,当破碎时间为10 min时破碎率仅为45%左右,而破碎时间增加到20 min时破碎率几乎增加一倍,达到85%左右,但超过20 min后,破碎率增长不大。当时间和占空比一定时,输出功率增大细胞破碎率变化不大。由4种实验方案综合来看,当占空比为50%、输出功率为150 W时,细胞破碎时间以20 min左右为宜,破碎率可达85%以上。 将冻融法和超声波法对细胞的破碎效果进行比较,冻融法在-30℃进行冷冻,共历经50 h多,最大破碎率则达到72.2%,而且需要高要求的冰柜,并且在反复冷冻融化的过程中,一些生物活性物质容易失活。而超声波法最多需时30 min,破碎率就可达到87.4%,而且设备简单,操作方便。由于超声波破碎是在冰浴中进行,且破碎需时短,因此可以避免活性物质的失活。由此可见,无论是从经济效益还是从实际应用的效果来看,超声波法破碎细胞要优于反复冻融法,是一种简便易行、适合采用的微藻细胞破碎方法。 2.3 细胞破碎率对藻红蛋白提取率的影响 取密度为0.665 g/L的紫球藻藻液,采用反复冻融法和超声波法进行细胞破碎,离心后取粉红色上清,用Bradford法测量其粗提物中藻红蛋白含量,其结果如图1和图2所示。 由图1中反复冻融法数据可以明显看出,随着冻融温度的降低,细胞破碎率明显增加,藻红蛋白粗提物含量也随之增加,当破碎率达到71%50.时藻红蛋白粗提物含量可达到2%,而当破碎率为31%时蛋白粗提物含量只有21.2%。 图2为采用超声波细胞破碎方法所得的破碎率与蛋白含量的数据,图中数据也同样表明,细胞破碎率增加有利于紫球藻藻红蛋白的提取,即随着细胞破碎程度增大,蛋白提取率也增加。当破碎率为47.6%时粗蛋白含量为34.3%,而当破碎率增加到83.4%时藻红蛋白粗提物的含量达到57.9%,当破碎率再增加时蛋白粗提物的含量基本不变。这一方面可能因为破碎率达到一定程度后,再提高破碎率就困难了,蛋白提取物的含量自然也就不再增加;另一方面是因为紫球藻中藻红蛋白含量是一定的,即使破碎率再增加,提取物的百分含量也是一定的。 3 藻红蛋白的分离