绿球藻choroccumspmc-1株系高盐碱培养适应性及虾青素积累特性的初步研究.docxVIP

绿球藻choroccumspmc-1株系高盐碱培养适应性及虾青素积累特性的初步研究 虾青素属于氨基酸丙烯酸酯。它是许多水生动物所需的营养成分和优良的颜色组合。它具有抗紫外辐射、抗癌、肿瘤等功能。虾青素抗氧化功能远远高于其它次生类胡萝卜素、维生素E和维生素C,因而倍受食品、制药和化妆品工业的青睐。 近年来,从微藻中开发高值化的天然虾青素在国际上引起了广泛的关注。雨生红球藻Haematococcus pluvialis在胁迫条件下可以大量积累虾青素,含量高达细胞干重的4%,远远高于其它生物。由于雨生红球藻生长速度慢,易受微生物污染,在培养过程中难以获得高产,使其产品成本高昂,严重妨碍了产业开发与推广。由此寻找可快速生长、积累虾青素的绿藻如小球藻Chlorella zofingiensis、绿球藻Chlorococcumsp.等绿藻作为替代种源受到广泛重视。 迄今为止,在世界上数万种微藻资源中,产业开发最为成功的仅有螺旋藻、小球藻和盐藻,藻种对高碱和(或)高盐的极端适应和快速生长特性对其产业开发起到关键作用。筛选极端适应和快速生长的微藻,建立低成本开放式养殖,提高细胞生物活性成分的含量,研究极端条件下生物活性物质的诱导与转化机制具有重要的理论与实践意义。 本研究对分离筛选到的耐碱性绿球藻开展生长特性、极端适应特性和虾青素诱导等方面进行的初步研究,探索合理开发天然虾青素的新方法与新思路,为其产业开发与深入研究打下基础。 1 材料和方法 1.1 藻类和繁殖方法 1.1.1 微藻体系的分离与纯化 本研究材料绿球藻株系MC-1(简称MC-1)由中国科学院南海海洋研究所微藻项目组于2002年在室外蓝藻培养箱中分离得到,后经固体纯化培养得到株系。 1.1.2 柠檬酸和土壤提取液 使用ZSNT培养基,配制方法为每升蒸馏水中分别加入1g NaCl、0.05g NaH2PO4·2H2O、1g NaNO3、0.02g CaCl2、0.05g MgSO4·7H2O、0.01 g柠檬酸以及M2、A5和土壤提取液各1ml,其中每升M2水溶液含有0.244g FeCl3·6H2O和0.189g Na2EDTA,每升A5水溶液含有2.86gH3BO3、0.22gZnSO4·7H2O、0.01gMOO3、1.80gMnCl2·4H2O和0.08gCuSO4·5H2O。ZSNT培养基pH为7.91,高压灭菌后根据实验设计的需要添加不同量的NaHCO3。 1.1.3 体外强光诱导细胞转红 耐碱性实验在培养室内进行,培养架光强为135μE·m-2·s-1,温度为28±2℃,光周期L∶D为24∶0。室外强光诱导细胞转红:将室内培养绿色细胞分2组转移到室外培养,其中1组维持室内培养时的营养盐条件,NaCl和NaHCO3浓度同为1g·L-1,另一组采用高盐高碱诱导,通过逐步加入NaCl和NaHCO3,使其终浓度分别为51g·L-1和81g·L-1, 总盐度大于130,太阳直射光最大光强约1 400 μE·m-2·s-1。 1.1.4 mc-1生长曲线的绘制 MC-1生长测定用Unicon-UV-2102紫外可见光分光光度计测波长700nm光密度值作为生物量指标,绘制MC-1的生长曲线并计算比生长率。 1.2 hplc分析 HPLC方法参考Yuan等的方法进行, 藻细胞经离心收集,弃上清液,用蒸馏水清洗,然后冷冻干燥。定量取冷冻干燥样品10—15mg,在避光条件下加液氮研磨, 丙酮反复提取直至样品变白为止。提取液低温高速离心(4℃,12 000r·min-1离心20min)去沉淀,上清液用氮气吹干,用甲醇/二氯甲烷(9.5∶3)定容为1.25 ml,然后进行HPLC分析。仪器采用美国Waters 1525型高效液相色谱仪,Waters2996型检测器,Waters反相色谱柱SymmetryShieldTMRP185μm(3.9mm×150mm)。HPLC流动相A液:二氯甲烷/甲醇/乙腈/水为10∶170∶11∶9;B液:二氯甲烷/甲醇/乙腈/水为44∶56∶91∶9。用100%的A液梯度洗脱0—8min;用0到100%的B液梯度洗脱8—15min;用0到100%的A液梯度洗脱15—16min;用100%的A液梯度洗脱16—25min。流速为1.0ml·min-1,进样体积20μl。2996型检测器在250—700nm波长范围扫描,在450nm处进行检测。用虾青素、叶黄素、角黄素、叶绿素b、叶绿素a和β-胡萝卜素(Sigma产品)做标准品。 类胡萝卜素含量测定参考Dere等的方法进行。 1.3 t检验的应用 实验设2个平行样,取其平均值。统计用Excel将实验组和对照组进行显著性t检验,以p0.05作为显著依据。 图1、2中所示值为平均值±标准差。 2 结果 2.1 比生长率及