姜黄素对肺癌细胞TFPI-2基因去甲基化作用研究.docxVIP

? ? 姜黄素对肺癌细胞TFPI-2基因去甲基化作用研究* ? ? 梁莹，吴西雅，肖祖克 江西省人民医院，江西 南昌 330000 肺癌系呼吸道恶性肿瘤，发病率及死亡率均处于第1位，现已成为全球主要健康问题[1]。据相关研究报道显示，肺癌每年新发病例超210万，且死亡人数超180万[2]，而1/3新发病例和2/5死亡病例均来自中国，且近几年来发病率有上升趋势[3]。目前，肺癌治疗以放化疗手段为主，虽可较好改善患者生存质量，但5年生存期仍较低。随着基因组时代及分子生物学的发展，表观遗传学已成为癌症研究的新热点，其调控机制包括DNA甲基化、非编码RNA表达及组蛋白修饰等，其中DNA甲基化与肿瘤发生、进展密切相关[4]。经癌症基因组图谱(the cancer genome atlas，TCGA)数据库筛选肺癌基因发现，组织因子途径抑制物-2(tissue factor pathway inhibitor-2，TFPI-2)启动子区异常甲基化可导致TFPI-2表达下降，促进肺癌细胞生长、浸润及转移[5-6]。而启动子异常甲基化于肿瘤早期或癌前便已出现，可较好预测肿瘤发生，具有较高特异性，基于此机制研发的靶向药物5-氮杂-2′-脱氧胞苷(5-Aza-2′-deoxycytidine，5-Aza-CdR)经美国食品药品监督管理局(food and drug administration，FDA)批准上市且推荐用于骨髓异常增生类疾病治疗。近年来研究发现，5-Aza-CdR在结肠癌[7]、口腔鳞状细胞癌[8]、胰腺癌[9]及肺癌[10]等实体瘤治疗中亦可发挥作用，但同样也发现5-Aza-CdR具有不良反应，可引起严重的胃肠道反应及骨髓抑制等。研究表明，从莪术、姜黄等中草药中提取出来的姜黄素可通过抑制肿瘤细胞增殖、血管生成、转移及抗炎等多途径发挥抗肿瘤作用，且可调控DNA甲基化，但相关机制尚未阐明[11-13]。基于此，本文以TFPI-2及DNA甲基转移酶1(DNA methyltransferase 1，DNMT1)、DNMT3a、DNMT3b等为切入点探讨姜黄素对TFPI-2基因甲基化的作用。 1 材料 1.1 细胞人肺腺癌A549细胞株，由中国科学院上海细胞生物学研究所提供，货号：ZQ0003。 1.2 药物与试剂姜黄素(美国Sigma公司，批号：C1386-10G)；DMEM培养基(美国Thermo fisher scientific公司，货号；MagicPure?Cell-Free DNA Kit II(含Magnetic Stand) DNA提取试剂盒、MagicPure?Simple Viral DNA/RNA Kit(含Magnetic Stand)RNA提取试剂盒、PerfectStart?Taq DNA Polymerase(含2.5 mM dNTPs)扩增试剂盒(北京全式金生物技术有限公司，货号：EC211、EC311、AP401)；引物合成委托美国Invitrogen公司完成。 1.3 仪器Applied Biosystems Veriti型PCR仪(美国Thermo fisher scientific公司)；Ts2型倒置相差显微镜(日本NIKON公司)；MDF-382E(N)型-86 ℃超低温冰箱(日本SANYO公司)；3-18KS型低温高速离心机(德国Sigma公司，离心半径：16 cm)；Gel Dox XR型凝胶成像系统(美国BIO-RAD公司)；SW-CJ-2F型超净工作台(苏州净化设备有限公司)。 2 方法 2.1 细胞培养、分组及干预将含细胞的冻存管投入37 ℃水温箱中迅速解冻，自主晃动待其完全融化后转移细胞悬液至含10%胎牛血清的DMEM培养基中，混匀后1 000 r·min-1离心5 min，弃上清后将其接种于细胞培养瓶中，置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养，待80%～90%细胞贴壁生长时，弃除旧培养液，采用PBS缓冲液冲洗细胞，并用0.25%胰酶消化后进行观察，当发现细胞质浓缩、圆润时添加 2 mL 培养基。将贴壁细胞作离心处理后，将1个培养瓶中的白色沉淀细胞均匀接种至3个新的培养瓶中并放于37 ℃、5%CO2培养箱中传代培养，取长势良好的对数生长期细胞，于37 ℃、5%CO2培养箱中培养24 h后，将细胞分别设置为姜黄素低剂量组、姜黄素中剂量组、姜黄素高剂量组及空白对照组。空白对照组细胞采用30 mL完全培养液进行培养，姜黄素各剂量组分别采用30 mL含20 μmol·L-1、40 μmol·L-1及80 μmol·L-1的培养液进行培养，24 h后弃除培养液，用PBS缓冲液冲洗细胞，收集处理后的A549细胞以待进一步实验。 2.2 MTT法检测A549细胞的增殖情况将