小鼠卵子老化过程中皮质颗粒的变化和自发孤雌激活的研究.docxVIP

? ? 小鼠卵子老化过程中皮质颗粒的变化和自发孤雌激活的研究 ? ? 杨尚武 黄 浩 王小婕 朱秀兰 宋亚丽 修良昌 邢福祺 1.南方医科大学附属南方医院妇产科生殖中心(广州，510515);2.南方医科大学附属南海医院;3.广东医学院公共卫生学院统计学教研室 ·基础研究· 小鼠卵子老化过程中皮质颗粒的变化和自发孤雌激活的研究 杨尚武1，2黄 浩2王小婕2朱秀兰1宋亚丽1修良昌3邢福祺1 1.南方医科大学附属南方医院妇产科生殖中心(广州，510515);2.南方医科大学附属南海医院;3.广东医学院公共卫生学院统计学教研室 目的:通过卵子老化过程中皮质颗粒的变化和自发孤雌激活比例，探讨老化卵子受精异常的原因。方法:对8～10周龄雌鼠注射孕马血清促性腺激素和绒毛膜促性腺激素14h后，于不同时间段取出MII期成熟卵子分作体内不同时间老化组(MII+0h、MII+6h、MII+12h、MII+18h);成熟M II+0h卵子取出后体外分别培养6h、12h、18h作为体外老化组。对各组卵子免疫荧光染色，共聚焦显微镜成像显示染色体形态和皮质颗粒分布。体内各组卵子取出后继续体外培养8h统计自发孤雌激活的比例和碎裂卵子数。结果:体内和体外MII+12h、MII+18h组自发皮质颗粒排放比例和皮质颗粒内迁数明显高于MII+0h、MII+6h组。体外MII+18h组自发皮质颗粒排放比例和皮质颗粒内迁数低于体内MII+18h组。体内MII+12h、MII+18h组卵子取出继续体外培养8h后孤雌激活比例和死亡比例明显高于体内MII+0h和MII+6h组。结论:卵子在老化过程中存在皮质颗粒自发排放和皮质颗粒内迁，以及自发孤雌激活和碎裂化，这些因素均可能导致老化卵受精能力的降低。卵子老化过程中皮质颗粒排放和内迁可能受到体内环境的影响。 小鼠 卵子 老化 皮质颗粒 孤雌激活 排卵后老化是指当卵母细胞到达第二次减数分裂中期(MⅡ)后，因未能受精，减数分裂不能继续完成，而持续停滞在这一阶段所发生的老化。卵母细胞的老化会导致妊娠率降低、流产率增加和出生缺陷。研究排卵后卵母细胞老化过程及机制，探讨延缓卵母细胞老化的有效措施，对于改进卵母细胞体外成熟和受精系统，完善辅助生殖技术并减少出生缺陷具有重要的理论价值。既往研究显示，皮质颗粒(CG)是卵子成熟和检验卵子质量的重要指标。本研究通过观察超排的小鼠成熟卵不同老化时间和老化环境下的CG变化以及老化卵体外培养自发孤雌激活的改变，探讨卵母细胞老化的变化规律及对受精和发育产生影响的可能因素。 1 材料与方法 1.1 动物与试剂、仪器 雌鼠购自北京大学北校区实验动物中心。孕马血清促性腺激素(PMSG)和绒毛膜促性腺激素(hCG)购自宁波制药厂。其他主要试剂和仪器有:碘化丙啶(PI)，异硫氰酸荧光素络合小扁豆凝集素(FITCLCA)(Sigma公司，美国);M2操作液、M16培养液、胎牛血清(Gibco公司，美国);leica解剖显微镜(莱卡公司，德国);ZEISS－510 META激光共聚焦显微镜(蔡司公司，德国)。 1.2 实验方法 1.2.1动物处理和分组8～10周ICR品系雌鼠于发情后期腹腔注射PMSG 10U，48h后腹腔注射hCG 10U，推定hCG注射14h后为卵子体内成熟MII期。分别于MII期后不同时间采取断颈法处死小鼠，取出卵子，作为体内不同时间老化组(MII+0h、MII+6h、MII+12h、MII+18h);另一批小鼠 MII期断颈处死取出卵子后，置入M16培养液于CO2培养箱培养6h、12h、18h，作为体外老化卵组。卵子获得:取出子宫输卵管，挑破输卵管膨大部位，得到卵丘复合物(COC)。用0.1%透明质酸酶消化颗粒细胞后得到MII卵，M2操作液洗3遍，转入Tyrode酸性液消化透明带，进行CG荧光染色。 1.2.2卵子CG荧光染色卵子去掉透明带后，4%多聚甲醛固定30min，于含0.3%胎牛血清蛋白(BSA)和100mmol/L甘氨酸的PBS液(阻断液)中洗3次，含0.1%聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX－100)的PBS(透膜液)中透膜5 min，再次置入阻断液中洗3次。100μg/ml FITC－LCA(以PBS稀释)避光孵育45min。含0.3%BSA和0.01%TritonX－100的PBS(洗脱液)洗3次，10μg/ml PI暗室环境下染核10min。DABCO封片，置于激光共聚焦显微镜上，用激发波长488nm光观察。成熟CG分布标准:卵子赤道面CG排布在质膜下，形成单层细致的光环，从皮质面观察可见CG的分布细致均匀。CG排放的标准:卵子赤道面质膜下CG光环断裂、不连续、伴凝集，从皮质面观察可见CG凝集成团块状、分布不均匀。CG内迁的标准:卵子赤道面CG数目≥6个。 1.2.3