DB35T 1555-2016水仙黄条病毒、水仙花叶病毒和水仙潜隐病毒 多重RT-PCR 检测方法.docxVIP

ICS 65.020.01 B16 福 建 省 地 DB35 方 标 准 DB35/T 1555—2016 水仙黄条病毒、水仙花叶病毒和水仙潜隐病毒 多重 RT-PCR 检测方法 Multiplex RT-PCR Method of Narcissus yellow stripe virus, Narcissus mosaic virus and Narcissus latent virus 2016 - 04 - 06 发布 2016 - 07 - 06 实施 福建省质量技术监督局 发 布 I DB35/T 1555—2016 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009《标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写规则》给出的规则编写。 本标准由福建出入境检验检疫局提出并归口。 本标准起草单位：福建出入境检验检疫局、福建农林大学。 本标准主要起草人：沈建国、高芳銮、金晶、李敏、虞赟、陈细红、陈寿铃。 1 DB35/T 1555—2016 水仙黄条病毒、水仙花叶病毒和水仙潜隐病毒 多重 RT-PCR 检测方法 1 范围 本标准规定了水仙黄条病毒、水仙花叶病毒和水仙潜隐病毒的多重RT-PCR检测方法。 本标准适用于水仙鳞球茎、植株中水仙黄条病毒、水仙花叶病毒和水仙潜隐病毒的多重RT-PCR检测。 2 规范性文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 SN/T 2122 进出境植物及植物产品检疫抽样方法 SN/T 2964 植物病毒检测规范 SN/T 3457 植物病毒分子生物学检测规范 3 有害生物基本信息 参见附录A。 4 原理 水仙黄条病毒、水仙花叶病毒和水仙潜隐病毒分子生物学特性是多重RT-PCR检测的主要依据。 5 仪器设备和主要试剂 5.1 仪器设备 高速冷冻离心机、电子天平(1/1000 g) 、PCR仪、电泳仪、水平电泳槽、 -20 ℃低温冰箱和-80 ℃ 超低温冰箱、凝胶成像分析系统、pH计、微波炉、磁力搅拌器、恒温水浴锅、高压灭菌锅、超净工作台 等。 5.2 主要试剂 多重RT-PCR检测试剂见附录B。 6 抽样和样品制备 6.1 抽样 抽样方法按照SN/T 2122中规定执行，尽可能抽取有病毒危害症状的材料，水仙黄条病毒、水仙花 叶病毒和水仙潜隐病毒的危害症状描述参见附录A。 2 DB35/T 1555—2016 6.2 样品制备 分别按照有症状和无症状进行样品制备，具体方法按照SN/T 2964和SN/T 3457中规定执行。 7 多重 RT-PCR 具体方法见附录B。 8 序列测定 PCR产物纯化、回收后， 进行克隆、测序， 或者直接测序。利用美国国立生物技术信息中心(NCBI) 网站上的BLAST软件把测序所得到的核苷酸序列与已知的相应病毒序列进行比对，同源性达到95%以上， 则判定为该病毒序列。 9 结果判定 9.1 当 RT-PCR 检测结果呈阳性，测定的序列为水仙黄条病毒序列，则判定为检出水仙黄条病毒。 9.2 当 RT-PCR 检测结果呈阳性，测定的序列为水仙花叶病毒序列，则判定为检出水仙花叶病毒。 9.3 当 RT-PCR 检测结果呈阳性，测定的序列为水仙潜隐病毒序列，则判定为检出水仙潜隐病毒。 9.4 当 RT-PCR 检测结果呈阴性，则判定为未检出对应目的条带大小的病毒。 10 结果判样品保存 经检测， 结果判定为阳性的样品应保存在-20 ℃或-80 ℃冰箱中， 并作好登记和标记工作， 以备复 核用。 11 记录 记录好各项实验数据， 包括样品来源、种类、时间， 实验的时间、地点、方法和结果等， 并要有经 手人和实验人员的签字。分子生物学检测结果保留电泳照片，序列测定结果保留测序报告图。 3 DB35/T 1555—2016 附 录 A (资料性附录) 水仙黄条病毒、水仙花叶病毒、水仙潜隐病毒的背景资料 A.1 分类地位 水仙黄条病毒： 学名： Narcissusyellow stripevirus，缩写： NYSV。 分类地位：马铃薯 Y 病毒科(Potyviridae)、马铃薯 Y 病毒属 (Potyvirus)。 水仙花叶病毒： 学名： Narcissusmosaicvirus，缩写：NMV。 分类地位：线性病毒科(Flexiviridae)、马铃薯 X 病毒属(Potexvirus)。 水仙潜隐病毒： 学名： Narcissus latentvirus，缩写：NLV。 分类地位：马铃薯 Y 病毒科(Potyviridae)、柘橙病毒属(Macluravirus)。 A.2