小麦amlo-1ac基因表达的初步研究.docxVIP

小麦amlo-1ac基因表达的初步研究 meo是通过图位突变法获得的大麦抗凝剂。随后Devoto等在水稻、拟南芥及其它一些植物中相继克隆了Mlo类似基因。Elliott等报告了小麦Mlo类似基因,并证明该基因与小麦抗白粉病有关。目前,小麦Mlo基因家族中已有6个全长基因和2个近全长基因在GenBank中登录,包括我们克隆的3个小麦Mlo基因(TaMlo-A1c,TaMlo-B1c,TaMlo-B1d)。TaMlo-A1c基因是小麦Mlo家族中的重要成员,Yu等证明了TaMlo-A1c是膜结合蛋白,属于具有7个跨膜结构域的植物特有的Mlo家族。Southern杂交表明TaMlo-A1c基因在小麦每个基因组中有1个拷贝。利用中国春缺失系将该基因定位在2AL、2BL和2DL的特定区段上。Northern杂交研究了该基因在白粉菌诱导后不同时间小麦叶片中的表达,但它在小麦其它器官中的表达还未见报道。Northern杂交是研究基因在转录水平表达的常规方法,一般以稳定表达的18 s rRNA作为对照。Actin是植物中的一个稳定表达的“管家基因”,在研究大麦和大豆基因转录水平中,尤其在RT-PCR中常用它作为对照。半定量RT-PCR方法以特异性高、操作简便和可靠性强的优点,在研究基因表达方面有逐渐取代Northern杂交的趋势。为了更深入研究小麦TaMlo-A1c基因的抗白粉病机制。本研究利用半定量RT-PCR方法,以小麦Actin基因作为对照,对小麦TaMlo-A1c基因在各个不同器官中的表达进行了研究。 1 材料和方法 1.1 不同光照、时间对小麦根系诱导的菌株 试验材料为小麦抗白粉病品系“99-2439”,将其种子播于培养皿中,用透明投影胶片与外界隔离以防止白粉菌孢子落入,在人工气候箱中按光照12 h、黑暗12 h光周期,18～20 ℃下培养。在幼苗长至一叶一心时,接种白粉菌,在接种后不同时间(1、4、12、24、48和72 h)分别取小麦的幼叶、根、诱导的根;小麦的壮叶、旗叶、幼穗、幼茎取自温室培养(15～25 ℃)的未人工接种白粉菌的“99-2439”材料。 1.2 关于总rna的检测 用TRIzol○R(Invitrogen,USA)试剂分别提取小麦幼叶、壮叶、旗叶、穗、茎、根等的总RNA。(1)定量:测260、280 nm处的吸光值,计算A260/A280的值,估计总RNA的纯度,通过A260的值分别对不同器官的总RNA进行定量。(2)RNA完整性的检测:在1%普通琼脂糖凝胶上分离总RNA,若有4条(代表rRNA等)清晰无拖尾的带,则说明总RNA完整。 1.3 合成第一链生物网络roche,ge建立 取等量不同器官的总RNA,用试剂盒“1st Strand cDNA Synthesis Kit for RT-PCR”(Roche,Germany)合成第一链cDNA。 1.4 semi-qt-pcr 1.4.1 pcr扩增条件 根据小麦Actin基因(GenBank查询号:gi序列,设计了一对特异性引物:WAC-F:5′-GTT CCA ATC TAT GAG GGA TAC ACG C-3′;WAC-R:5′-GAA CCT CCA CTG AGA ACA ACA TTA CC-3′。PCR扩增采用25 μL反应体系,分别加入等量不同器官的cDNA(3 μL)模板,1倍的PCR缓冲液(10 mmol/L的Tris-HCl,pH 8.5～9.0,50 mmol/L的KCl,0.1%的Triton-100),200 μmol/L的dNTP,1.5 mmol/L的MgCl2,0.4 μmol/L的Actin基因特异引物,1 U Taq DNA聚合酶。反应在Perkin-Elmer 9600热循环仪上进行。反应程序:94 ℃预变性3 min,94 ℃变性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,18个循环;72 ℃延伸5 min。小麦Actin基因扩增产物长度为422 bp。取等体积的PCR产物加上样缓冲液经1%琼脂糖凝胶电泳,EB染色,紫外灯观察照相。 1.4.2 特异性引物pcr扩增 根据已克隆的小麦TaMlo-A1c基因(GenBank登录号:AF384144)序列,设计了一对特异性引物,F1:5′-GAT TCA TCT CGC TGC TGC-3′;R1:5′-TGG CTG TCT GCT CGT CAA AG-3′。PCR扩增条件同1.4.1,其扩增产物长度为1 050 bp。取等体积的PCR产物加上样缓冲液经1%琼脂糖凝胶电泳,EB染色,紫外灯观察照相。 2 结果与分析 2.1 小麦actin、tamlo-a1c基因的表达 TaMlo-A1c基因是通过反转录聚合酶链式反应(RT-PC