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荧光动力学分析法检测超氧自由基抑制剂抗氧活性的新方法 超氧自由基（2）（o2）破坏生命的巨大破坏和各种疾病。因此，2o2o2o2o2o2o是研究的前提，使用三酚自氧化产生三乙二醇、二o二醇。用分光光度法确定三酚自氧化的产物，间接测定三乙二醇。2o二二o二羧基驱蚊剂的抗氧活性是实验室中最常用的方法。此外，还有单扫描极谱法、氧电极法、化学修养法等间接测定。到目前为止，还没有报道使用荧光法进行检测。这项工作的研究表明，一种新的荧光动力学分析方法使用了抗坏死酸、糊精素和丙烯酸酯等一般活性剂。该方法与单扫描极谱法和分光光度法进行了比较。结果表明，该方法操作简单，翻译能力好，精度好。 1 实验部分 1.1 焦性没食子酸溶液ro RF-540型荧光分光光度计(日本岛津);JP-2A型示波极谱仪(成都仪器厂);PERKIN-ELMER LAMDA 17 UV/VIS紫外分光光度计(美国); pHS-3C数字酸度计(杭州万达科学仪器仪表厂). 0.010 0 mol/L邻苯三酚:准确称取焦性没食子酸0.126 2 g,加经除氧10 min后的水溶解,定容至100 mL;2.0 mg/mL抗坏血酸、2.0 mg/mL槲皮素、0.5 mg/mL芦丁贮备液.芦丁、槲皮素(上海试剂二厂,生化试剂).以上贮备液均保存于4℃冰箱中.0.200 0 mol/L 三羟甲基氨基甲烷(Tris,生化试剂, 北京奥博星生物技术责任有限公司),0.2 mol/L 盐酸,在酸度计的监测下将二者混合,配成 Tris-HCl缓冲溶液(pH 2.00～12.00,pH=8.20).以上试剂除指明外均为分析纯.全部实验用水为二次石英亚沸重蒸水.除氧用高纯氮气. 1.2 荧光动力学实验 向1 cm的石英比色皿中加入2.20 mL Tris-HCl缓冲溶液,0.10 mL水、0.30 mL邻苯三酚,快速摇匀.立即记录Ex=433.0 nm,Em=494.5 nm光谱条件下的荧光动力学曲线,该曲线0～6 min部分的斜率为v0.在另一洁净的石英比色皿中加入上述试剂,并在加入邻苯三酚前加入适量的Οˉ?2O?ˉ2清除剂(μL级)和水,保持总体积为2.60mL,按相同的方法实验,该曲线0～6min部分的斜率为vS.按下式计算抑制剂对Οˉ?2O?ˉ2的抑制率: 抑制率(%)=v0-vSv0×100%. 2 结果与讨论 2.1 抑制剂的选择性 紫外光谱研究表明:邻苯三酚(Ⅰ)在碱性条件下可被氧化为醌(Ⅲ),这是一个2步单电子转移过程,其间要经过半醌自由基(Ⅱ):其中第1步反应迅速(K1=1×106m-1·s-1),而第2步则是1个相对慢的衰减过程(K2=0.02s-1),另外产物Ⅲ会发生双聚反应,形成Ⅳ,Ⅳ与O2继续作用生成Ⅴ. 氧化产物Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ均具有较强的荧光效率,荧光强度随时间的延长而增大.利用这一特性可以间接检测Οˉ?2的生成并测定抑制剂对Οˉ?2的抑制作用. 2.2 荧光动力学曲线 2.2.1 光谱条件的选择 对仅含邻苯三酚的Tris-HCl缓冲溶液(pH=8.20)进行荧光分光光度法实验.以Em=494.5nm,Ex=250～700nm为光谱条件,对新配制的溶液立即记录其激发光谱,在Ex=433.0nm处有1个激发峰,相对荧光强度随时间的延长而逐渐增大(图1,曲线a);重新取液在Ex=433.0nm, Em=250 ～700nm的光谱条件下立即记录其发射光谱,在Em=494.5nm处得到1个发射峰,相对荧光强度亦随时间的延长而逐渐增大(图1,曲线b).从而得到荧光法间接检测Οˉ?2的最佳激发波长和发射波长分别为433.0 nm和494.5 nm.以此2波长为时间扫描的光谱条件,测定溶液的荧光动力学曲线,在0～12 min内,荧光强度与时间成线性关系.本文记录0～6 min时间内的荧光动力学曲线(图2,曲线1),并每隔0.5 min读取1个相对荧光强度,以时间为横坐标、相对荧光强度为纵坐标进行线性回归,其斜率为邻苯三酚自氧化的反应速率(v0). 2.2.2 pH及缓冲溶液用量的影响 实验结果表明邻苯三酚自氧化反应的速率随pH的增大而增大,但荧光动力学曲线的线性范围随pH的增大而略有减小,pH增高会降低抑制剂对邻苯三酚自氧化抑制的灵敏度,这些与文献报道一致.综合以上原因,本文将pH选为8.20.固定邻苯三酚的用量为0.30 mL,改变Tris-HCl缓冲溶液(pH=8.20)的用量,保持溶液的总体积为2.60 mL,测定荧光动力学曲线.结果表明,缓冲溶液的用量为2.00～2.40 mL时时间扫描曲线的线性关系最好,斜率和荧光强度最适宜.故本实验选择2.20 mL为底液条件. 2.2.3 邻苯三酚体积用量的影响 向1 cm的比色皿中加入2.20 mL Tris-HCl缓冲溶液(pH=8