电针不同穴位对肠易激综合征大鼠精神行为及NMDA受体表达的影响研究∗.docx

? ? 电针不同穴位对肠易激综合征大鼠精神行为及NMDA受体表达的影响研究? ? ? 覃 颖 王一凡 郭孟玮 蓝 莹 王 珊 吉毛先 朱文莲 任晓暄 （北京中医药大学，北京 100029） 肠易激综合征（IBS）是一种典型的身心性疾病，伴有腹痛、腹泻等腹部症状[1]。精神心理障碍是其重要病机之一[2]，与腹部症状通过脑-肠轴[3]相互影响，使“心”和“身”两方面的病症不断加重。因此，在治疗IBS时，应注重“心”即精神情绪方面的治疗，达到“心身”同调。 印堂与大椎穴均能调神，同属督脉，但二穴在功能上有所差异，印堂穴偏向于治疗不寐虚证、郁证等，而大椎穴偏向于治疗小儿惊风、癫狂痫证等。既往研究表明，NMDA受体与精神情绪等密切相关[4]。因此本实验以IBS模型大鼠为研究对象，通过比较电针“印堂”“大椎”二穴对IBS模型大鼠的腹部回撤反射检测（AWR）、旷场实验（OFT）以及实时荧光定量PCR检测前扣带回皮层（ACC）中NMDA受体的阳性表达，观察不同穴位对IBS情绪异常是否具有疗效及其效应差异，以此阐释经穴效应特异性。 1 材料与方法 1.1 实验动物 购入清洁级健康Wistar孕鼠5只，清洁柜饲养，室温维持在（23±2）℃，12 h昼夜交替，自由饮水。 1.2 试药与仪器 电子秤（ER-182A型，日本）；电针仪（LH-202H型，北京祯怡科技发展公司）；毫针（0.30 mm×13 mm，北京中研太和科技有限公司）；BL-420S生物机能实验系统（成都泰盟科技有限责任公司）；双腔儿科导尿管（BARD-FOLEY，美国）；乙酸、液体石蜡（北京化学试剂公司）；10%中性甲醛（北京百诺威生物科技有限公司）；2%戊巴比妥钠（北京欧北科技生物科技有限公司）；Tirzol试剂（美国Invitrogen公司），反转录酶、Taq酶、PCR试剂（Promega公司）；PCR引物由北京奥科生物技术有限公司合成。 1.3 造模与分组 孕鼠生产后，将幼鼠随机分为空白对照组、模型对照组、印堂组和大椎组，每组10只。除空白对照组外均造模，同等条件饲养。本实验方案符合实验动物伦理委员会伦理学规定。通过母婴分离加醋酸灌肠结合结直肠扩张（CRD）联合造模。方法如下：幼鼠出生2～21 d于8∶00～11∶00进行3 h的母婴分离。8～21 d给予0.5%醋酸灌肠，具体灌注量见表1。22～42 d不予任何干预。6周龄时给予CRD刺激（将润滑后的6F导尿管经大鼠肛门插入，深度约为7 cm，固定，待大鼠适应，用0.5 mL/min的速度均匀缓慢地向导尿管中注水0.5 mL扩张结直肠，维持30 s，以出现腹部抬起为准。重复3次，每次间隔5 min），加强模型的稳定性。造模至8周龄，普通喂养。 表1 IBS幼鼠模型制备醋酸灌注量（mL） 1.4 干预方法 两电针组在第9周进行电针治疗。穴位定位参照《实验针灸学》[5]：“印堂”（两眼中点偏上2 mm处，斜刺2 mm）；“大椎”（第7颈椎与第1胸椎间，直刺5 mm）。具体操作如下：固定大鼠，将针具刺入相应穴区，并在其旁开约1 mm的同一穴区再刺入1针，两针不相接触，以防短路。连接韩氏电针仪，同一对正负极连接同名穴区的两针柄，疏密波，2/100 Hz，强度以引起大鼠肢体微动为度，20 min/次，隔日1次，共5次。 1.5 检测指标 1）腹部回撤反射检测（AWR）：禁食不禁水8 h后进行AWR。本实验参照Al-Chaer[6]的方法予以改良，具体方法：自制球囊，将球囊、微量注射泵、压力换能器与BL-420S生物机能实验系统连接，并检查保证管路的密封性。固定大鼠：将大鼠放至与微量注射泵同高度的位置，固定并将润滑后的球囊头端缓慢插入肛门约8 cm，用胶布带与鼠尾固定。安抚大鼠等其适应后打开微量注射泵，以1 mL/min的速度匀速缓慢注水，共1.5 mL，使球囊扩张，持续时间为90 s。标记起始收缩波的潜伏期、收缩波个数。同一只大鼠检测3次（时间间隔30 min以上），取其平均值统计。2）旷场试验（OFT）：AWR测试后的第2天进行。适应实验环境约10 min后，打开自主行为装置，将大鼠放入敞箱中央，记录大鼠在5 min内水平和垂直运动（两个前肢同时竖立记为1次）的次数。每次测试后，清理敞箱，不留异物异味。3）实时荧光定量PCR检测NMDA receptor1（NR1）、NMDA receptor2A（NR2A）、NMDA receptor2B（NR2B）表达水平。麻醉处死大鼠，取脑组织，检测ACC中NMDA表达。NMDA receptor1：sense：5′-GCTGTACCTGCTGGACCGCT-3′，antisense：5′-GCAG TGTAGGAAGCCACTATGATC-3′，predicted size（bp）：