哮喘大鼠肺与大肠组织表面蛋白amrna表达改变及针刺调节的初步研究.docxVIP

哮喘大鼠肺与大肠组织表面蛋白amrna表达改变及针刺调节的初步研究 肺与结肠的内外结合是中医肠道内外理论的组成部分之一。肺与大肠在生理上相互联系, 病理上相互影响。有资料表明, 二者的密切联系具有生物医学依据。以往认为肺表面活性蛋白 (surfactant protein, SP) 只在肺内存在, 且有A、B、C、D 4种亚型, 其中以SP-A含量最为丰富, 是降低肺泡表面张力, 维持肺泡稳定和正常的呼吸功能的重要物质。近来发现, 在结肠和小肠表面也有SP-A基因存在和蛋白表达, 表明肠道表面和肺表面存在密切联系。本实验从针灸治疗哮喘为切入点, 观察了哮喘大鼠肺与大肠SP-A mRNA表达改变及针刺对其的调节, 为脏腑相关的物质基础研究和针灸效应研究提供依据。 1 材料和动物 1.1 动物质量合格 雄性Sprague-Dawley大鼠, 清洁级, 体质量 (130±30) g, 由吉林大学实验动物中心提供, 动物质量合格证号 1.2 仪器和检测设备 卵蛋白, OVA, 美国Sigma公司进口分装, 批氢氧化铝, 长春新华宇生物科技有限公司, 批戊巴比妥钠, 美国Sigma 公司进口分装, 批号200901111;TRIzol, 美国Invitrogen公司产品;氯仿, 北京市化工厂产品, 批 DEPC原液, Sigma公司进口分装;琼脂糖, 西班牙Biowest公司产品;RT-PCR一步法试剂盒, 美国Promega公司产品;DNA Marker, 北京天根生化科技有限公司产品;引物序列, 宝生物工程大连有限公司产品。SMUP-B型生物信号处理系统, 上海嘉龙教学仪器厂产品;呼吸流量测定系统, 美国Kent Scientific Corporation产品;呼吸流量实验测量软件, 复旦大学医学院生理教研室提供;Allegra X-22R低温高速离心机, 德国Beckman Coulter公司产品;5418小型高速离心机, Eppendorf公司产品;TC-512 PCR扩增仪, 英国Techne公司产品;Cintra 202型紫外分光光度计, 澳大利亚GBC公司产品;DYY-12C型水平电泳系统, 北京六一仪器厂产品;Power Pac HV电泳仪, 美国Bio-Rad公司产品;TANNON-2010数码凝胶图像分析系统及GIS凝胶图像分析软件, 上海天能科技有限公司产品;Milli-DI超纯水系统, 美国Millipore公司产品。 1.3 含卵蛋白的单次注射 将48只SD大鼠随机分成空白对照组、捆绑组、假手术组、哮喘模型组、原络配穴组 (太渊、偏历) 、原穴组 (太渊) 6组。 哮喘模型组的处理参照文献方法:将SD大鼠在实验第1天一次性向腹腔注射含卵蛋白0.250 g和氢氧化铝凝胶0.250 g的生理盐水1.5 mL以致敏, 第15天将大鼠用5 g/L戊巴比妥钠麻醉后固定于手术台上, 行气管插管术, 并于颈外静脉内注射卵蛋白 (0.250 g/kg体质量) 激发哮喘发作。原络配穴组大鼠、原穴组大鼠第1天致敏, 腹腔注射后1 h进行针刺治疗, 于实验第15天激发哮喘发作, 方法同上。假手术组大鼠于第1天腹腔注射1.5 mL生理盐水, 第15天以等量生理盐水 (1 μL/g) 行颈外静脉注射, 方法同上。空白对照组大鼠不做任何处理, 正常饲养。 1.4 穴位选取方法 穴位定位据《实验针灸学》确定。针刺方法:平补平泻, 每次留针20 min, 每隔5 min行针1次, 隔日针刺1次, 共针7次。 原络配穴组自实验第1天开始进行针刺治疗, 穴位选取太渊 (双) 、偏历 (双) ;原穴组穴位选取太渊 (双) ;捆绑组自实验第1天起开始捆绑, 不针刺, 每次20 min, 隔日绑1次, 共捆绑7次。 1.5 指标和方法的检测 1.5.1 总rna的提取及国家机关检测 大鼠放血处死后, 迅速在冰盘上切取肺、大肠组织。组织选取部位:肺组织——取左肺下叶肺尖 (1 cm×1 cm) ;大肠组织——自阑门向大肠方向2.5 cm 处取1 cm肠段。组织切取后用锡纸包好, 迅速做好标记放入液氮中冷冻, 使液氮渗透到组织内部而防止组织内部发生RNA降解, 后移至-80 ℃超低温冰箱中保存。 用TRIzol法抽提组织中的总RNA, 所得总RNA经紫外分管光度计检测纯度及浓度。用紫外分光光度计检测波长260 nm和280 nm的吸光度值, D260/D280的比值在1.8～2.0之间的予以保留, 其余弃去不用。总RNA原液稀释一定比例, 使样品总RNA溶液的D260值在0.1～0.4之间, 放入通光池中检测, 利用公式计算总RNA的浓度。根据所测RNA浓度调整PCR体系中