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黄芪对糖尿病肾病大鼠肾损害的保护作用 随着糖尿病发病率的增加，各种检查和ct扫描逐渐增多，造影剂（cm）引起的急性肾损伤越来越多。造影剂肾脏黄酮症是糖尿病患者肾衰竭的重要原因之一。一项研究显示糖尿病氮质血症期进行心导管检查,CMN发生率高达50%,尽管多数患者肾功能短期内可以恢复,但常常增加住院天数,加重患者负担,少数甚至死亡,因而预防和治疗这种并发症具有重要意义。近年来,研究证实内皮素(ET)系统可能在CMN发生中起重要作用,有效抑制造影时ET系统的过高表达,具有一定的肾脏保护作用。但目前ET拮抗剂在临床上还未得到广泛运用,有研究证实黄芪可降低血浆及肾脏局部ET-1水平,具有抑制ET系统表达的作用,推测可用于预防CMN发生。为此,我们建立了单侧肾切除糖尿病肾病模型,对此进行探讨。 材料和方法 1 尿糖的检测 雄性Wistar系大鼠(体重180～200 g,温州医学院动物房提供)30只,其中24只接受右侧肾切除(背部正中切口),2周后腹腔单剂量注射链脲佐菌素(STZ,Sigma公司)60 mg/kg(溶解在10 mmol/L枸橼酸缓冲液中,pH 5.5),48～72 h后尾静脉采血,用血糖仪(One Touch Ⅱ型,强生有限公司)测定全血血糖,血糖≥16.7 mmol/L,同时尿糖+++～++++以上确定为糖尿病大鼠,给普通饲料,自由摄水,饲养8周,随机分组。其他6只作为正常对照组。 2 糖尿病模型建立前煤为5d模型 (1)正常对照组(C组,n=6);(2)糖尿病对照组(DM组,n=6):糖尿病模型建立8周时,禁水24 h,1次性尾静脉注入等量生理盐水;(3)糖尿病+造影剂组(DM+CM组,n=6):糖尿病模型建立8周时,等量生理盐水灌胃,禁水24 h,1次性尾静脉注入76%泛影葡胺(10 mg/kg);(4)糖尿病+黄芪+造影剂组(DM+HQ+CM组,n=6):糖尿病模型建立8周时,黄芪(2 g/250 g)灌胃,禁水24 h,1次性尾静脉注入76%泛影葡胺(10 mg/kg)。 3 肾组织中et-1及etr-b的表达 分别在CM注射后12～36 h,用代谢笼收集尿标本,然后用3%水合氯醛腹腔注射,麻醉各组大鼠,行右侧颈总动脉插管,留取血浆,-70 ℃保存,待测肌酐和ET-1。肾脏经生理盐水充分灌洗,用4%多聚甲醛固定,石蜡包埋,制成4 μm厚切片,做免疫组织化学。 血、尿肌酐由日立7150型全自动生化分析仪测得;血浆ET-1用放射免疫法测定(试剂盒由北京美迪科学技术有限公司提供)。 免疫组化:SP法检测ET-1、ETR-A及ETR-B在肾组织中的表达。石蜡切片常规脱蜡到水,加入3%H2O2-甲醇溶液室温下10 min消除内源性过氧化物酶活性,用蒸馏水冲洗3次后加入抗原修复液(购自上海金浩公司),然后置于微波炉中煮沸10 min后自然冷却,再用0.1 M PBS溶液(pH 7.4)漂洗3次,加入正常山羊血清室温下封闭15 min,倾去玻片上的血清,分别滴加兔抗大鼠ET-1(1∶500,购自北京中山试剂有限公司),绵羊抗大鼠ETR-A(1∶200,购自上海普飞生物技术有限公司)、ETR-B(1∶200,购自上海普飞生物技术有限公司),室温下过夜。次日用PBS液漂洗3次,分别滴加生物素标记的羊抗兔IgG、驴抗绵羊IgG置于40 ℃烤箱中15 min,弃去二抗后用PBS液漂洗3次,加入辣根过氧化物酶标记链酶卵白素工作液室温下15 min,用PBS液漂洗3次后于室温下滴加DAB显色液,镜下控制显色时间。充分显色后水洗终止显色,再用Hariss苏木素复染、1%盐酸酒精分化。酒精梯度脱水、二甲苯透明后以中性树胶封片。同时采用正常兔血清和删除第一抗体的方法作为阴性对照。 显色结果在高倍镜(×400)下根据染色面积和强度进行半定量分析:-,无阳性染色;+,轻度阳性;++,中度阳性;+++,重度阳性。 4 统计方法 数据用(xˉ±s)(xˉ±s)表示,组内差异比较采用t检验,组间差异比较采用方差分析。 结果 1 糖尿病大鼠对小鼠血清泛影葡胺,血胱被控制监测总剂量,导致血肌病 单侧肾切除糖尿病大鼠,喂养8周时,血肌酐较正常大鼠明显升高,血浆ET-1浓度、肌酐清除率明显降低,有统计学意义(P0.05)。糖尿病大鼠黄芪灌胃,禁水24 h后注射76%泛影葡胺,血肌酐有所升高,内生肌酐清除率有所下降,与糖尿病对照组无明显差异,与生理盐水灌胃组有显著性差异(P0.05);血浆ET-1浓度较糖尿病对照组和生理盐水灌胃组有所升高,但无统计学意义。见表1。 2 肾组织病理学检测 在光镜下观察,糖尿病大鼠与正常大鼠相比,肾小球大致正常,肾脏间质有程度不同单核细胞浸润。注射CM后,无论生理盐水灌胃组,还是黄芪灌胃,病理变化与糖尿病组相比均不显著。 3 dm和d