6株溶磷菌和固氮菌混合培养条件的优化.docxVIP

6株溶磷菌和固氮菌混合培养条件的优化 1925年，科学家们发现了不同菌株的混合培养可以产生不同的产品。研究认为混合培养能减少或避免纯培养过程中生物活性下降的现象,增加培养菌生物量,可以获得更多的菌株性质。陶光灿等研究了细菌组合的固氮,解磷与不同培养条件以及混合培养的研究表明,微生物之间存在着协同作用,这是一个潜能巨大的新的微生物资源,正在逐渐成为新的研究热点。常慧萍等对小麦根际的解磷菌、解钾菌和固氮菌进行了互作研究发现:当两菌株混合后,解磷菌P1616可以促进固氮菌N2106-L生长,提高了混合菌悬液中的细胞密度,解磷菌P1616还可以促进解钾菌KL0405的生长。 温度,pH和盐分浓度对菌体生长影响很大,在微生物发酵的过程中要严格控制温度,pH和盐分浓度才能有最大的有效活菌数。溶磷菌和固氮菌混合对温度、pH和盐分浓度等环境因素的响应不同,本研究旨在确定混合菌株对环境因子的适应范围,为后续溶磷菌和固氮菌混合菌剂研制提供理论依据。 1 材料和方法 1.1 来源：蘑菇 供试菌株为甘肃农业大学草地微生物多样性实验室提供的6株溶磷菌,4株固氮菌(表1)(3株联合固氮菌和1株根瘤菌)。 1.2 细菌生长状况 分别将活化后的菌株两两相交划线接种在LB平板培养基上,28 ℃培养2～3 d,每天观察交叉点处细菌生长状况,若交叉点两细菌生长弱或不生长,说明两菌株间有拮抗作用,不适合混在一起做复合菌肥;若交叉点细菌生长良好,则说明两菌株可以共存,之间没有抑制作用,不发生拮抗反应的各菌株可以混合培养,可以做复合菌肥。 1.3 微生物浓度的测定 将各供试菌株划线接种于LB固体斜面上,28 ℃下培养24 h,加灭菌水制成菌悬液,用UV-721紫外分光度计在D660nm下测定菌悬液浓度,并用无菌水调节D值一致后,备用。 1.4 蘑菇处理 A组 6株溶磷菌单独培养(共计6个处理);B组 6株溶磷菌和4株固氮菌两两组合(共计24个处理)。 1.5 组合菌种制备 (1)将LB液体培养基分装至试管中,每管5 mL,121 ℃灭菌30 min,备用。 (2)将菌株按0.1 mL接种量接种到液体试管培养基,组合菌每个菌接种0.05 mL,每个菌种组合接种3管,分别标上10、15、20、25、30、35、40、45 ℃标记。 (3)按标记,将各试管置于相应温度的振荡培养箱中培养48 h。 (4)取出观察各菌株的生长情况,测定每个菌株的D660 nm吸光值,并计算平均值,以确定各菌株的最适生长温度。 1.6 菌株组合lb液体培养基 (1)配置LB液体培养基,分装为11份,分别采用1 mol/L的NaOH和1 mol/L的HCl依次调节pH 4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0,再将LB液体培养基分装至试管中,每管5 mL,分别标上pH 4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0标记,121 ℃灭菌30 min,备用。 (2)将菌株菌悬液按0.1 mL(单菌株)接种量接种到液体试管培养基,组合菌每个菌接种菌悬液0.05 mL(菌株组合),每个组合接种3管。 (3)将标记好的菌株置于28 ℃振荡培养箱中培养48 h,转速为180 r/min。 (4)取出观察各菌株的生长情况,并测定其D660 nm的平均吸光值,确定菌株及组合的最适生长pH。 1.7 平板的制作 在LB培养基中加入NaCl配成1%、3%、5%、7%、9% 5个浓度梯度,灭菌后制成平板备用。将配好的各处理菌悬液以划线法接种于各盐浓度的LB固体培养基上,每个处理3个重复,以不接种的为对照,置28 ℃下培养7 d,观察菌体生长情况。 2 结果与分析 2.1 抗阻试验 拮抗试验是鉴定菌株间菌株菌能否共存的传统方法,6株溶磷菌和4株固氮菌之间均无拮抗反应发生,各菌种可以混合培养。 2.2 溶磷菌的d60dm值 由图1～6可以看出,温度对单菌株和混合菌的影响较大,各供试菌株在10～45 ℃均能生长,但差异较显著;各菌株或菌株组合从10～45 ℃的D660 nm值先增加,到25 ℃或30 ℃时到达峰值,随后开始下降,25～35 ℃是最佳培养温度。 在图1溶磷菌Jm170和根瘤菌S11组合接种在各温度D660 nm值低于单菌株Jm170和Jm170与其他固氮菌组合。在图2～6中,Jx59+G组合在10～45 ℃范围内D660 nm值均高Jx59与其他固氮菌和根瘤菌的组合,当30 ℃时到达峰值,为1.125;溶磷菌Lx81、Lx191、Jm92、Lx22与固氮菌和根瘤菌的组合的D660 nm值在25～45 ℃均显著高于Lx81单独接菌时的D660 nm值;在图5,6中,Jm92+W5和Lx22+G是较优菌株组合,在10～45 ℃D6