细胞生物学实验报告_2.docVIP

细胞生物学实验报告 细胞生物学实验报告 叶绿体的分离、纯化与荧光观察 【实验目的】 ⒈通过植物细胞叶绿体的分离与纯化，了解细胞器分离与纯化的原理和方法。 ⒉熟悉荧光显微镜的使用方法，观察叶绿体的自发荧光和间接荧光。 【实验原理】 ⒈叶绿体是植物细胞所特有的能量转换细胞器，叶绿体是植物细胞所特有的能量转换细胞器，光合作用就是在叶绿体中进行。由于具有这一重要功能，所以它一直是细胞生物学、遗传学和分子生物学的重要研究对象。叶绿体是植物细胞中较大的一种的细胞器，利用低速离心即可分离集中进行各种研究。 叶绿体结构模式图 组织细胞的破碎方法很多，包括机械法（研磨法、 匀浆法、胶体磨法）和非机械法（超声波法、有机溶法、溶胀法、酶解法）。除了某些细胞外的多肽激素和某些蛋白质与酶以外，对于细胞内或多细胞生物组织中的各种生物大分子的分离纯化，都需要事先将细胞和组织破碎，使生物大分子充分释放到溶液中，并不丢失生物活性。不同的生物体或同一生物体的不同部位的组织，其细胞破碎的难易不一，使用的方法也不相同。 ⒉细胞器分离的过程包括两个主要阶段：碎细胞和细胞组分的分离。将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行离心，差速离心和密度梯度离心是分离亚细胞组分的常用方法。 ⑴差速离心 ①原理：一个颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状和密度，也同离心力以及悬浮介质的粘度有关。在一给定的离心场中，同一时间内，密度和大小不同的颗粒其沉降速率不同。依次增加离心力和离心时间，就能够使非均一悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部，分批收集即可获得各种亚细胞组分。 ②事例：叶绿体的分离应在等渗溶液（0.35mol/L 氯化钠或 0.4mol/L 蔗糖溶液）中进行，以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。将匀浆液在1000r/min 的条件下离心 2min，以去除其中的组织残渣和一些未被破碎的完整细胞。然后，在 3000r/min 的条件下离心 5min，即可获得沉淀的叶绿体（混有部分细胞核）。分离过程最好在 0~5℃的条件下进行；如果在室温下，要迅速分离和观察。 ③特点：介质密度均一，速度由高到低，逐级离心。 ④用途：分离大小相差悬殊的细胞和细胞器。 ⑤沉降顺序：核——线粒体——溶酶体与过氧化物酶体——内质网与高基体——核蛋白体。 差速离心可将细胞器初步分离，常需进一步通过密度梯度离心再行分离纯化。 ⑵密度梯度离心 ①原理：用一定的介质在离心管内形成连续的密度梯度，将细胞悬浮液或匀浆置于介质的顶部，通过离心力的作用使细胞或细胞器分层、分离，最后不同密度的细胞或细胞器位于与自身密度相同的沉降区带中。 ②分类 速度沉降——分离密度相近而大小不同的物体。 等密度沉降——分离密度不同的物体。 ⒊荧光的概念 ①光致发光：某些物质在照射下，吸收光能进入激发态，当从激发态回到基态时，可以以电磁辐射的形式释放出吸收的光能，这种现象称为“光致发光”。紫外辐射、可见光及红外辐射均可引起光致发光，如磷光与荧光。 ②荧光：在光致发光中，如果一定波长的短波光（如紫外光）照射某种物质，这种物质吸收光能后进入激发态，并且立即退激发在极短的时间内能发射出比照射光波更长的光（如可见光） ，这种光就称为荧光。一旦停止入射光，发光现象也随之立即消失。荧光分为自发荧光或诱发荧光（次生荧光、续发荧光、间接荧光）。某些物质受激发光照射后可直接发出荧光，如叶绿素、血红素的火红色荧光或木质素的黄色荧光的等，称为自发荧光（直接荧光）。某些物质本身不发荧光，但它经荧光染料染色后，再通过紫外线照射同样也能发出荧光，这样荧光称为诱发荧光，如叶绿体被咩啶橙染色后可发桔红色荧光。 ⒋染色剂 吖啶橙是一种与 DNA 和 RNA 都能结合的荧光染料，在紫外线或蓝光（330~485nm）激发下，DNA可被激发出 530nm 的荧光发射峰（细胞核发亮绿 色荧光），RNA 可被激发出 640nm 的荧光发射峰（核仁和胞质 RNA 发桔红色荧 光）。产生两种不同荧光是由于吖啶橙与双链 DNA 和单链 DNA 或 RNA 的结合方 式和结合量不同而决定的。DNA 是高度聚合物，它与 DNA 结合是潜入双链之间， 结合量相对少；而与单链 DNA 或 RNA 的结合则由静电吸引堆积在磷酸根上，结合量相对多些。我们推测，叶绿体的次生荧光的来由，大部分来自叶绿体的吸附作用，极少部分来自于叶绿体中的RNA。 【实验用品】 ⒈材料 新鲜菠菜 ⒉仪器 普通或高速离心机、电子天平、荧光显微镜、剪刀、研钵、移液管、漏斗、滴管、10ml离心管。 ⒊试剂 ⑴0.35mol/L 的 NaCl 等渗溶液。 ⑵0.01% 吖啶橙（acridine orange）——称取 0.1g 吖啶橙加蒸馏水 100ml 做母液，储存于棕色瓶，置 4℃冰箱保存。临用前取