细胞融合实验报告 山大.docVIP

山东大学实验报告 2013年 9 科目 细胞生物学实验 题目 动物细胞融合 第 PAGE 1 页 共 NUMPAGES 3 页 细胞生物学实验报告· 动物细胞融合 【实验目的】 了解动物细胞融合的常用方法。 学习化学融合和电融合的基本操作过程。 观察动物细胞融合过程中细胞的行为和变化。 【实验原理】 细胞融合是指在自发或者诱导条件下，两个或两个以上细胞合并为双核或者多核细胞的过程。目前人们已经发现有很多方法可以诱导细胞融合，包括病毒诱导融合、化学诱导融和和电激诱导融合。? 1、病毒诱导融合 仙台病毒、牛痘病毒、新城鸡瘟病毒和疱疹病毒等可以介导细胞的融时也可介导细胞与细胞的融合。用紫外线灭活后，这些病毒即可诱导细胞发生融合。? 2、化学诱导融合? 很多化学试剂能够诱导细胞融合，如聚乙二醇(PEG)、二甲基亚砜、山梨醇、甘油、溶血性卵磷脂、磷脂酰丝氨酸等。这些物质能够改变细胞膜脂质分子的排列，在去除这些物质之后，细胞膜趋向于恢复原有的有序结构。在恢复过程中想接触的细胞由于接口处脂质双分子层的相互亲和与表面张力，细胞膜融合，胞质流通，发生融合。化学诱导方法，操作方便，诱导融合的概率比较高，效果稳定，适用于动、植物细胞，但对细胞具有一定的毒性。PEG是广泛使用的化学融合剂。? 3、电激诱导融合? 包括电诱导、激光诱导等。其中，电诱导是先使细胞在电场中极化成为偶极子，沿电力线排布成串，再利用高强度、短时程的电脉冲击破细胞膜，细胞膜的脂质分子发生重排，由于表面张力的作用，两细胞发生融合。电诱导方法具有融合过程易控制、融合概率高、无毒性、作用机制明确、可重复性高等优点。 【实验用品】 材料 鸡血红细胞。 试剂 50%PEG、GKN溶液、Alsever’s细胞保存液、0.85%氯化钠溶液。? 器材 倒置显微镜、离心机、载玻片、盖玻片、离心管、废液缸等。 【操作步骤】 取鸡血2ml+2mlAlsever液，再加入6mlAlsever液，混匀后制悬液（4℃保存）【老师已做好】 取1ml+4ml的0.85%的NaCl溶液，在1200r/min下离心5min； 将离心后的沉降血球（去上清后约0.1-0.2ml，加入GKN至1-2ml，使之成10%的细胞悬液； 取上述10%的血球悬液1ml,加入3mlGKN液，使每毫升含血； 取（4）1ml+0.5ml50%PEG，或取（4）0.5ml+0.5ml50%PEG，或取（4）0.5ml+1.0ml50%PEG，混匀滴片，在常温下2-3min后，镜下观察。 【实验结果】 第一组1ml+0.5ml50%PEG（10X40） 第二组0.5ml+0.5ml50%PEG（10X40） 第三组0.5ml+1.0ml50%PEG（10X40） 【实验结果分析与注意事项】 分析： 1、结果中由于PEG的作用，细胞变形情况较为严重。? 2、因为PEG作用时间长，细胞受到严重损伤；且混合液粘度较高，没有观察到细胞的运动情况。? 3、因为PEG有的凝集作用，红细胞发生多细胞的凝集反应。? 4、因融合时间短的缘故，没有观察到细胞的完全融合。 注意： 1、制备的鸡血红细胞悬液的浓度不宜过高，否则细胞溶液聚集，融合效果受影响。浓度可根据具体情况调节。 2、PEG对细胞融合的作用效果与毒害作用随着分子量的增加而增大，在实验过程中一般取其分子量800-6000。若做细胞融合培养实验则需考虑融合细胞的成活率，故使用分子量不大于1000的PEG溶液；做细胞融合实验，本次试验中采用分子量为4000的PEG。? 3、PEG对细胞融合的作用效果和毒害作用随着浓度的增加而增大。在实验过程中一般采用40%-60%浓度的PEG溶液。? 4、在制备鸡血红细胞时要反复离心洗涤制备的鸡红细胞液以清洗掉杂质。