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4种伪狂犬疫苗多重pcr扩增的研究 伪病毒素（pm）也被称为嗜毒症，是由嗜毒症科和嗜毒症科（ad）引起的一种或几种动物感染的急性传染病。猪是唯一的自然宿主,是病毒的长期贮存和排出者,在伪狂犬病的传播上起着重要的作用。该病毒可引起怀孕母猪流产、死胎、木乃伊胎;新生仔猪衰竭死亡,死亡率可达100%;成年猪多呈隐性感染,长期带毒排毒,成为该病的主要传染源,可进行水平传播和垂直传播。国外一些专家认为,PR给养猪业造成的经济损失仅次于猪瘟和口蹄疫。世界动物卫生组织(World Organization for Animal Health,OIE)将其列为法定报告动物疾病的B类多种动物共患病,我国也将其列为二类传染病。 PR在我国流行范围很广,迄今为止已有20多个省份发生过该病。自20世纪70年代以来,人工筛选的自然弱毒疫苗及基因工程缺失疫苗的广泛应用,对防制伪狂犬病做出重要贡献。随着PCR技术的建立和广泛应用,国内外许多学者开始逐渐将其应用于PRV的检测[9,10,11,12,13,14]。我国使用的Bartha-k61株弱毒疫苗,其基因中有包括整个gE和大部分gI序列的缺失。美国研制出的世界上第一个伪狂犬病病毒基因工程缺失疫苗(OMNIVAC-PRV),在1986年获得美国政府颁发的生产许可证,这一疫苗其中也缺失了gE基因。20世纪90年代以后,欧美等国家规定只允许含gE基因缺失的疫苗生产上市。目前,不少国家又研制出了不同的基因缺失疫苗,它们都具有不同的表型,但大多数缺失苗都表现在gE和TK基因的缺失上,这是因为gE和TK基因都是PRV的主要毒力因子,作用在于能降低PRV对猪神经系统入侵能力,并且gE基因是PRV复制所非必需的。gB是病毒的一个重要包膜组分和中和抗原,是所有糖蛋白中最保守的,对于病毒的感染必不可少,而gB基因对PRV的复制也是不可缺少的。鉴于此,笔者根据最保守存在的gB及缺失的gE或TK基因序列,设计了3对引物,建立了检测猪伪狂犬疫苗毒和野毒的三重PCR方法。该方法可以应用于PR疫苗毒和野毒的准确、快速诊断和流行病学调查,同时对于预防、治疗及消灭PR也有重要作用。 1 材料和方法 1.1 猪繁殖与呼吸综合征病毒病毒属5种 猪伪狂犬病毒(PRV),2型猪圆环病毒(PCV2),猪细小病毒(PPV),猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪瘟病毒(CSFV)均由农业部畜禽病毒学重点开放实验室分离保存。 1.2 na聚合酶、dntp、dnamar UNIQ-10柱式病毒DNA抽提试剂盒购自上海生工;TaqDNA聚合酶(5 U/μl)、dNTP(25 mmol/L)、2×GC Buffer、DL2000 DNA Marker均购自Takara公司;DNA片段快速胶回收试剂盒购自北京博大泰克。 1.3 方法 1.3.1 dna的提取 商品化的冻干疫苗用研磨杵研为粉末,置于1.5 ml Eppedorf管中,后加入200 μl的TE Buffer(pH 8.0)溶解,随后按照DNA抽提试剂盒说明书进行。PRV细胞毒及商品化的液体乳化苗则直接按说明书进行操作。制备的DNA模板于-20 ℃保存备用。 1.3.2 引用属性 根据GenBank中PRV的gB、gE、TK基因序列设计3对引物PB1、PB2; PE1、PE2; PT1、PT2。序列如表1所示。 1.3.3 优化pcr扩增条件 对PCR的引物浓度、dNTP的浓度及PCR的扩增条件进行优化,筛选出PCR扩增最佳反应模式。 1.3.4 桑尼公司测序 将PCR产物用DNA片段快速胶回收试剂盒回收,送往上海桑尼公司测序。利用基因分析软件DNAStar分析测序结果,将所测定基因序列与已公布的PRV基因序列比较。 1.3.5 特异性试验 用上述检测方法对PCV2、PPV的DNA和PRRSV、CSFV的cDNA进行检测,以验证该检测方法的特异性。 1.3.6 pcr检测dna 按上述方法提取DNA,用紫外分光光度计测量DNA含量为1 375 μg/μl,并将DNA从10-1~10-10稀释作为模板,进行PCR扩增。 1.3.7 子牙菌的检测 将市售的四种商品化疫苗作为被检材料,进行PCR检测。 2 结果与分析 2.1 pcr方法的构建和产物序列分析 2.1.1 pcr引物、tk引物、taq酶活性 通过对PCR反应条件与试剂的优化,确定下列反应方案:20 μl 反应体系中加入2×GC Buffer 10 μl,dNTP 2 μl,gB引物各0.4 μl,gE引物各0.3 μl ,TK引物各0.35 μl,Taq酶0.5 μl,模板2 μl,H2O 3.4 μl。反应条件为95 ℃预变性5 min,95 ℃变性50 s,61 ℃退火1 min,72 ℃延伸45 s,35个循环,72 ℃延伸10