丙型肝炎检测讲解.pptx

丙型肝炎检测;目前丙型肝炎检测;;丙型肝炎病毒抗体检测;一、抗-HCV检测目标意义 ;二、抗-HCV检测办法 ;（一）筛查试验;2、化学发光试验;（2） 化学发光酶免疫分析法：从标识免疫分析角度，化学发光酶免疫分析（CLEIA)应属酶免疫分析，只是反应底物是发光剂，操作步骤与ELISA分析完全相同。以酶标识生物活性物质（如酶标识抗原或抗体）进行免疫反应，免疫反应复合物上酶再作用于发光底物，在信号试剂作用下发光，用发光信号测定仪进行发光测定。该办法又分为如下几类： ① HRP （辣根过氧化物酶）标识CLEIA：常用底物为鲁米诺或其衍生物如异鲁米诺。是一类主要发光试剂。鲁米诺氧化反应在碱性缓冲液中进行，在过氧化物酶及活性氧（过氧化阴离子O2-，单线态氧O2，羟自由基OH-，过氧化氢H2O2)存在下生成激发态中间体，当其回到基态时发光，其波长为425nm。早期用鲁米诺直接标识抗原或抗体，但标识后发光强度减少而使敏捷度收到影响。近来用过氧化物酶标识抗体，进行免疫反应后利用鲁米诺作为发光底物，在过氧化物酶和起动发光试剂（NaOH2H2O2）作用下，鲁米诺发光，发光强度依赖于酶免疫反应物中酶浓度。 ; ② 增强发光酶免疫分析（enhanced luminescence enzyme immunoassayELEIA）在发光系统中加入增强发光剂以增强发光信号， 并在较长时间内保持稳定， 便于反复测量， 从而提升分析敏捷度和精确性。 ③ ALP（辣根过氧化物酶）标识CLEIA 所用底物为环1，22二氧乙烷衍生物，用于化学发光酶免分析底物而 设计分子构造中包括起稳定作用基团—金刚烷基，其分子中发光基团 为芳香基团和酶作用基团，在酶及起动发光试剂作用下引发化学发光。 ;3 胶体金法迅速试验 ;（二）抗体补充试验 ;（三）抗-HCV检测策略及成果报告 ;第13页;2、临床诊断有关检测策略及成果报告 ⑴筛查试验 用筛查试剂进行初筛，成果成阴性反应，报告“抗-HCV阴性”；成果成阳性反应，不能出具阳性报告，必须进入复检试验。对初筛呈阳性反应样品用原有试剂双孔或原有试剂加另一种不一样原理（或厂家）试剂进行复检试验，如均呈阴性反应，报告“抗-HCV阴性”；如均呈阳性??应或一阴一阳反应，进行补充试验。临床诊断筛查检测流程见图4 ;第15页;(2)补充试验 ;第17页;⑵临床诊断补充试验办法-2 ;第19页; 初筛和复检均为阳性，且有样品OD值与临界值（Cutoff）比值（S/CO）≥试剂说明书中给出特定阈值，可报告“抗-HCV阳性”，无需再做免疫印迹试验；不然，还应深入作免疫印迹试验。免疫印迹试验成果阳性者，报告“抗-HCV阳性”；成果不确定者，报告“抗-HCV不确定”并进行随访。;3、血液筛查有关检测策略及成果报告;第22页; 4. 检测成果解释 ; 丙型肝炎病毒抗原检测 ;（二）HCV抗原检测办法; 大部分HCV抗原检测试剂检测是样品中游离关键抗原以及和抗-HCV结合关键抗原，因此在进行检测之前需要加入尿素、盐酸及去垢剂等，以解离样品中关键抗原-关键抗体免疫复合物。其他操作程序与一般ELISA或发光技术操作基本相同，即：第一步加入待测样品，孵育后，洗 去未结合成份，加入酶标识或发光物质抗关键抗原二抗，孵育后显 色，再加入终止液终止显色，用酶标仪比色计算s/co值，来进行阴性和阳性 反应判断。 ; 将HCV抗原标准物质稀释成不一样浓度系列标准，还可进行HCV抗原定量检测。以横坐标为HCV抗原浓度（pg/ml ），纵坐标为OD值，绘制出标准曲线。测出待测样品OD值后来，在标准曲线上查出抗原浓度。假如待测样品OD值超出标准曲线上最高抗原浓度OD值，则需用阴性血清将样品稀释后来再行检测。 ;（三)检测策略及成果报告 ; 丙型肝炎病毒核酸检测 ;（四）检测成果解释 ;（二）HCV核酸检测办法;2、TMA检测技术 ;3、实时荧光定量PCR技术 ; 荧光定量PCR检测HCV RNA操作程序包括：RNA提取、PCR扩增、荧光检测及成果分析。目前一般荧光定量PCR仪都带有对应分析软件，辅助设定阈值及Ct值，也允许操作者在合理范围内自行调整。一种 良好PCR反应反应到标准曲线上，就是标准曲线有关性良好，（r2一般＞0.99），斜率（反应扩增效率）在指定范围内。但采取外标法定量试剂盒标准品扩增良好也不一定意味着样品一定扩增良好，由于还包括RNA提取质量问题，因此尤其要注意考查阳性质控和阴性质控成果，阴性成果必须没有扩增曲线，而阳性质控必须扩增曲线良好，成果落入指定区间